1. Préparation des réactifs
- Préparez 500 mL de PBS en dissolvant 137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 4,3 mM de Na2HPO4, 1,47 mM de KH2PO4, dans ddH2O. Ajustez le pH à 7,4 avec du HCl. Stérilisez à l’autoclave.
- Préparez 100 mL de milieu RPMI : milieu RPMI-1640 avec de la L-Alanyl-Glutamine complétée par 10 % de sérum de veau fœtal (FBS), de la pénicilline (100 U/mL) et de la streptomycine (100 μg/mL).
- Préparez 50 ml de NaHCO3 0,1 M dans de l’eau distillée. Ajuster le pH à 8,1, filtrer la stérilisation (0,22 μm) et stocker à 4 °C
note: Pour deux plaques d’analyseur de flux extracellulaire à 8 puits, préparer 250 μL de 0,1 M de NaHCO3 pH 8,1.
- Préparez 1 mL de 2 M de D-glucose dans de l’eau distillée. Filtrer la stérilisation (0,22 μm) et l’entreposer à -20 °C.
- Préparez 100 μL de 1 mM d’oligomycine A dans de l’éthanol. Filtrer la stérilisation (0,22 μm) et l’entreposer à -20 °C.
- Préparez 250 μL de 1 M de 2-désoxy-D-glucose (2-DG) dans du DMEM minimal (milieu d'aigle modifié de Dulbecco). Réchauffez à 37 °C et ajustez le pH à 7,4 (effectuez une mesure du pH à 37 °C). Filtrer la stérilisation (0,22 μm) et l’entreposer à -20 °C.
- Préparez 100 μL de 1 mM de FCCP (cyanure de carbonyle-p-trifluorométhoxyphénylhydrazone) dans du DMSO. Filtrer la stérilisation (0,22 μm) et l’entreposer à -20 °C.
- Préparez 100 μL de 1 mM de roténone dans de l’éthanol. Filtrer la stérilisation (0,22 μm) et l’entreposer à -20 °C.
- Préparez 100 μL d’antimycine A à 1 mg/mL dans de l’éthanol. Filtrer la stérilisation (0,22 μm) et l’entreposer à -20 °C.
- Juste avant l’utilisation, préparez 10 mL de milieu d’essai d’effort de glycolyse. Réchauffez le DMEM minimal à 37 °C dans un bain-marie et ajustez le pH à 7,4 (effectuez une mesure du pH à 37 °C).
- Avant l’utilisation, préparez 10 ml de milieu d’essai d’effort Cell Mito avec du BSA. Supplément Minimal DMEM avec 2 mM de L-glutamine, 10 mM de D-glucose, 1 mM de HEPES (pH 7,4), 1 mM de pyruvate et 0,1 % de BSA (albumine sérique bovine). Réchauffez à 37 °C dans un bain-marie et ajustez le pH à 7,4 (effectuez une mesure du pH à 37 °C).
- Avant l’utilisation, préparer 10 mL de milieu d’essai d’effort Cell Mito sans BSA. Complétez Minimal DMEM avec 2 mM de L-glutamine, 10 mM de D-glucose, 1 mM d’HEPES (pH 7,4) et 1 mM de pyruvate. Milieu d’essai de stress Warm Cell Mito sans BSA à 37 °C dans un bain-marie et ajustez le pH à 7,4 (mesure du pH à 37 °C).
REMARQUE : Le BSA est ajouté au milieu de test de stress Cell Mito parce que les cellules répondent mieux au FCCP lorsque le milieu est complété par du BSA (différentes conditions ont été testées). Le support de test de résistance Cell Mito sans BSA est utilisé pour le chargement des ports, car le fabricant ne recommande pas l’utilisation de BSA dans le support.
2. Culture nocturne de cellules mononucléées
REMARQUE : Effectuez toutes les sous-étapes dans une hotte de culture de tissus stérile.
- Préparez deux flacons T75 avec 20 mL de RPMI. Dans chaque fiole, ajoutez 30 x 106 cellules mononucléées isolées. Incuber les cellules avec le ballon debout pendant 16 à 24 h à 5 % de CO2 et 37 °C.
3. Préparation des plaques recouvertes d’adhésif cellulaire
- Revêtement de deux plaques d’analyseur de flux extracellulaire à 8 puits.
note: Effectuez l’enrobage dans une hotte de culture de tissus stérile.
- Ajouter 2,2 μL d’adhésif cellulaire (densité : 2,54 mg/ml) à 250 μL de NaHCO3 0,1 M, pH 8,1, et pipeter immédiatement 12,5 μL de la solution dans chaque puits.
note: Les solutions mères d’adhésif cellulaire peuvent différer dans leur densité, ajustez le volume ajouté au NaHCO3 en conséquence.
- Laissez les plaques reposer dans le capot pendant environ 20 minutes, puis aspirez l’adhésif cellulaire et lavez chaque puits deux fois avec 200 μL d’eau stérile. Laissez-le reposer dans le capot avec le couvercle ouvert jusqu’à ce que les puits soient secs.
- Utilisez les plaques immédiatement ou économisez jusqu’à 1 semaine à 4 °C avec le bord enveloppé dans un film de paraffine pour éviter la condensation. Assurez-vous que les plaques sont réchauffées à température ambiante (pendant environ 20 min) dans la hotte avant d’ensemencer les cellules.
4. Hydratation de la cartouche du capteur
REMARQUE : Hydratez deux cartouches d’analyseur de flux extracellulaire à 8 puits.
- Séparez la plaque utilitaire et la cartouche du capteur. Placez la cartouche du capteur à l’envers sur la paillasse du laboratoire.
- Remplissez chaque puits de la plaque utilitaire avec un calibre de 200 μL. Remplissez chaque fossé autour de l’extérieur des puits avec 400 μL de calibre.
- Remettez la cartouche du capteur sur la plaque utilitaire qui contient maintenant l’étalon.
- Placez la cartouche dans un incubateur humidifié, sans CO2, à 37 °C pendant la nuit.
- Allumez l’analyseur de flux extracellulaire et laissez-le chauffer à 37 °C pendant la nuit.
5. Semis de cellules dans des plaques recouvertes d’adhésif
cellulaire
REMARQUE : Pour le test de stress de glycolyse, utilisez un milieu de test de stress de glycolyse. Pour le test d’effort Cell Mito, utilisez le milieu d’essai d’effort Cell Mito avec BSA.
- Cellules germes pour le test de stress de glycolyse et le test de stress Cell Mito dans des plaques séparées. Pour chaque test, utilisez des cellules d’une fiole avec une culture pendant la nuit.
- Cellules de centrifugation à 200 x g pendant 5 min à température ambiante. Remettre les cellules en suspension dans 1 mL du milieu approprié et les compter.
- Ajouter 4 x 106 de cellules vivantes au volume final de 400 μL (utiliser un milieu approprié).
- Plaque de suspension cellulaire de 50 μL dans les puits B-G. S’assurer que 500 000 cellules sont ensemencées dans un seul puits.
note: Il est crucial d’ensemencer exactement 500 000 cellules par puits car aucune autre normalisation n’est effectuée. De cette façon, les résultats de différents patients peuvent être comparés. Le nombre optimal de répétitions est de six, comme décrit ici. Il n’est pas recommandé d’utiliser moins de répétitions, car les cellules primaires peuvent parfois se comporter de manière erronée.
- Ajouter 180 μL du milieu approprié dans les puits A et H (ces puits serviront de correction de fond).
- Centrifuger la plaque à 400 x g pendant 5 min à température ambiante avec le frein réglé sur 1.
- Ajouter lentement et soigneusement 130 μL de milieu approprié aux puits B-G dans deux plaques d’analyseur de flux extracellulaire à 8 puits. Confirmez visuellement que les cellules adhèrent de manière stable au fond des puits en les observant au microscope.
- Placez la plaque dans un incubateur humidifié, sans CO2, à 37 °C pendant 30 min.
6. Chargement de la cartouche du capteur
- Pour le test d’effort de glycolyse, préparez 250 μL chacun de 100 mM de glucose, 20 μM d’oligomycine A et 1 M 2-DG, le tout dans un milieu de test de stress de glycolyse.
- Pour l’essai d’effort Cell Mito, préparer 250 μL chacun d’oligomycine A, 15 μM FCCP, 30 μM FCCP et un mélange de 10 μM de roténone et 10 μg/ml d’antimycine A, le tout dans un milieu d’essai d’effort Cell Mito sans BSA.
note: Il est recommandé d'injecter deux concentrations de FCCP dans un seul test car il n'y a pas assez de matériel pour le titrage du FCCP. Néanmoins, les concentrations doivent être déterminées par le chercheur.
- Chargez les composés dans les orifices d’injecteur appropriés de la cartouche comme suit (Tableau 1) :
7. Configuration du programme
- Pour le test d’effort de glycolyse, configurez le programme comme décrit dans le tableau 2.
- Pour le test d’effort Cell Mito, configurez le programme comme décrit dans le tableau 3.
- Démarrez le programme. Remplacez la plaque d’étalonnage par la plaque d’essai (lorsque vous y êtes invité).
cellulaire
| port | Test d’effort de glycolyse | Test d’effort de mito |
| Charger vers le port | Concentration finale dans les puits | Charger vers le port | Concentration finale dans les puits |
| un | 20 μL de glucose 100 mM | 10 mM de glucose | 20 μL d’oligomycine A 20 μM | 2 μM d’oligomycine A |
| L | 22 μL d’oligomycine A 20 μM | 2 μM d’oligomycine A | 22 μL de 15 μM FCCP | 1,5 μM FCCP |
| L | 25 μL de 1 M 2-DG | 100 mM 2-DG | 25 μL de 30 μM FCCP | 4,5 μM FCCP |
| D | L | | 25 μL de roténone 10 μM et 10 μg/ml d’antimycine A | 1 μM de roténone et 1 μg/ml d’antimycine A |
Tableau 1 : Volumes composés.
| pas | Paramètres |
| étalonnage | Automatique |
| équilibration | Automatique |
| Mesure de référence | Trois fois : Mélanger – 3 min, Attendre – 0 min, Mesurer – 3 min |
| Injection de l’orifice A | injection |
| mesure | Trois fois : Mélanger – 3 min, Attendre – 0 min, Mesurer – 3 min |
| Injection de l’orifice B | injection |
| mesure | Trois fois : Mélanger – 3 min, Attendre – 0 min, Mesurer – 3 min |
| Injection de l’orifice C | injection |
| mesure | Quatre fois : Mélanger – 3 min, Attendre – 0 min, Mesurer – 3 min |
Tableau 2 : Programme du test d’effort de glycolyse.
| pas | Paramètres |
| étalonnage | Automatique |
| équilibration | Automatique |
| Mesure de référence | Trois fois : Mélanger – 3 min, Attendre – 0 min, Mesurer – 3 min |
| Injection de l’orifice A | injection |
| mesure | Trois fois : Mélanger – 3 min, Attendre – 0 min, Mesurer – 3 min |
| Injection de l’orifice B | injection |
| mesure | Trois fois : Mélanger – 3 min, Attendre – 0 min, Mesurer – 3 min |
| Injection de l’orifice C | injection |
| mesure | Trois fois : Mélanger – 3 min, Attendre – 0 min, Mesurer – 3 min |
| Injection de l’orifice D | injection |
| mesure | Trois fois : Mélanger – 3 min, Attendre – 0 min, Mesurer – 3 min |
Tableau 3 : Programme du test d’effort Cell Mito.
