Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Jour 1 : Préparation des lymphocytes T à partir des souris donneuses
- Utilisez des souris CD45.2+ H2kb+ C57BL/6 de type sauvage (WT) comme donneurs de lymphocytes T.
- Euthanasier les souris C57BL/6 par asphyxie au dioxyde de carbone (CO2) et attendre 2 à 3 minutes jusqu’à ce qu’elles soient inconscientes. Effectuer une luxation cervicale comme euthanasie secondaire si nécessaire.
- Nettoyez soigneusement la fourrure et la peau de la souris avec de l’éthanol à 70 %. Exciser la rate et les ganglions lymphatiques et les séparer en une suspension unicellulaire de splénocytes à l’aide d’un piston de seringue et de crépines à mailles de 40 μm. Lavez la passoire et le piston de la seringue avec 1 % de RPMI (1 % de FBS contenant un milieu RPMI) pour recueillir tous les splénocytes.
- Centrifuger la suspension cellulaire à 800 x g pendant 5 min à 4 °C. Ajouter 5 mL de tampon de lyse ACK (1 mM Na2EDTA, 10 mM KHCO3, 144 mM NH4Cl, pH 7,2) après avoir jeté le surnageant. Incuber la suspension cellulaire pendant 5 min à température ambiante.
note: Le tampon de lyse ACK est utilisé pour lyser les globules rouges.
- Ajouter 5 ml d’IARP à 1 % pour arrêter la lyse. Centrifuger à 800 x g pendant 5 min à 4 °C. Jeter le surnageant.
- Préparez un tampon de tri cellulaire activé par aimant (MACS) glacé (0,5 % BSA, 2 mM EDTA dans PBS, pH 7,2). Dégazez le tampon avant utilisation. Remettre les pastilles de cellule en suspension dans 5 mL de tampon MACS.
- Comptez les splénocytes et vérifiez la présence de cellules vivantes et mortes à l’aide d’un hémocytomètre et de 1 % de bleu trypan. Enregistrez une aliquote de 2 x 106 cellules pour évaluer le rendement de purification avec une analyse par cytométrie en flux.
- Remettre les splénocytes en suspension à la concentration de 200 x 106/mL dans un tampon MACS. Ajouter 0,03 μL de biotine anti-souris-Ter-119, 0,03 μL de biotine anti-souris-CD11b, 0,03 μL de biotine anti-souris-CD45R et 0,03 μL de biotine anti-souris-DX5 par 106 cellules. Incuber 15 min à 4 °C.
note: La biotine anti-souris-Ter-119, la biotine anti-souris-CD11b, la biotine anti-souris-CD45R et la biotine anti-souris-DX5 ont été utilisées pour réagir avec les érythroïdes, les granulocytes, les cellules B et les cellules NK respectivement. Par conséquent, ces sous-ensembles de cellules sont épuisés à l’étape suivante.
- Ajoutez 10 ml de tampon MACS glacé à la suspension cellulaire. Centrifuger à 800 x g pendant 5 min à 4 °C. Jeter le surnageant.
- Remettre en suspension les pastilles de cellules dans le tampon MACS à une concentration de 100 x 106/mL. Ajouter des microbilles anti-biotine (0,22 μL/106 cellules) à la suspension de splénocytes. Bien mélanger et incuber pendant 15 minutes supplémentaires à 4 °C. Laver une fois la suspension cellulaire avec 10 ml de tampon MACS glacé. Centrifuger à 800 x g pendant 5 min à 4 °C et jeter le surnageant.
- Mettez une colonne de séparation magnétique dans le champ magnétique. Rincez la colonne avec 3 mL de tampon MACS. Déposez la suspension cellulaire sur la colonne. Recueillir le flux composé de cellules T enrichies non liées, dans un nouveau tube conique de 15 ml. Lavez la colonne MS avec 3 mL de tampon MACS glacé.
note: Assurez-vous que la colonne est vide avant d’effectuer les étapes de lavage.
- Centrifuger la suspension cellulaire à 800 x g pendant 5 min à 4 °C. Remettre la pastille cellulaire en suspension dans 5 mL de tampon MACS.
- Comptez les cellules en bleu trypan à 1 % à l’aide d’un hémocytomètre. Enregistrez une aliquote de 2 x 106 cellules pour un contrôle de pureté par cytométrie en flux.
note: Le rendement moyen des lymphocytes T spléniques isolés par cette méthode est de ~20−25 x 106 cellules par souris.
