Génération de cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse : une méthode pour générer des cellules dendritiques à partir de moelle osseuse de souris

Résumé

Source :Nguyen, H. D., et al. Plateforme de transplantation de moelle osseuse pour étudier le rôle des cellules dendritiques dans la maladie du greffon contre l’hôte. J. Vis. Exp.. (2020).

Cette vidéo décrit un protocole pour la génération de cellules dendritiques - des cellules présentatrices d’antigènes clés qui activent les cellules T - à partir de la moelle osseuse d’une souris adulte.

Protocole

1. Générer des cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse (BM-DCs).

1. Isoler la moelle osseuse des fémurs et des tibias de souris WT ou de facteur B (fB)^-/- sur le fond B6. Brièvement, prélevez le tibia et le fémur des deux jambes à l’aide de pinces et de ciseaux. Mettez-les dans un IPRP glacé contenant 1 % de FCS et 100 U/mL de pénicilline/streptomycine et 2 mM de L-glutamine (1 % RPMI) dans des tubes coniques de 50 mL. Nettoyez soigneusement le fémur et les os du tibia en enlevant tous les tissus musculaires à l’aide de pinces et de ciseaux. Transférez le fémur et le tibia des tubes coniques de 50 mL dans une boîte de Pétri de 92 mm de diamètre contenant 1 % de RPMI. À l’aide de ciseaux, coupez les extrémités du fémur ou du tibia. Remplissez un tube de 50 ml avec 25 ml de milieu RPMI 1640 à 1 %. Utilisez-le pour remplir une seringue de 3 ml attachée à une aiguille de 26 g avec 3 ml d’IPPM à 1 %. Insérez cette seringue dans l’os et poussez le piston pour évacuer la moelle osseuse (BM) de la cavité dans le tube de prélèvement avec 1 % RPMI (~3 mL/os). Faites tourner les cellules à 800 x g pendant 5 min.
2. Remettre la pastille en suspension dans 5 mL de tampon de lyse ACK pour la lyse des globules rouges. Incuber la suspension cellulaire pendant 5 min sur de la glace. Ajouter 10 mL de RPMI à 1 % dans la suspension cellulaire pour arrêter la lyse et centrifuger à 800 x g pendant 5 min à 4 °C. Jeter le surnageant.
3. Remettre les pastilles de cellules en suspension dans 10 mL de milieu de culture (RPMI 1640 contenant 10 % de FBS, 100 U/mL de pénicilline/streptomycine, 2 mM de l-glutamine et 50 mM de β-mercaptoéthanol) et ajuster le volume pour atteindre la concentration finale de 2 x 10⁶ cellules/mL.
4. Ajouter 20 ng/mL de facteur de stimulation des colonies de granulocytes et de macrophages (GM-CSF) à la suspension cellulaire. Cultivez les cellules de la moelle osseuse dans des boîtes de Pétri de 100 x 15 mm à 37 °C dans 5 % de CO₂ pendant 6 jours.
5. Remplacer la moitié du milieu de culture en cours (environ 5 ml) par un milieu frais contenant 40 ng/ml de GM-CSF le jour 3.
6. Préchauffez le milieu de culture dans un bain-marie à 37 °C. Prélevez environ 5 ml du milieu dans les boîtes de culture de moelle osseuse. Centrifuger à 800 x g pendant 5 min à 4 °C. Jeter le surnageant. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans un milieu de culture de 5 mL contenant 40 ng/mL DE GM-CSF.
7. Ajouter 25 μg/mL de lipopolysaccharide (LPS) dans le milieu au 6e jour de la culture pour faire mûrir les BM-DC. Conservez une aliquote de 2 x 10^{cellules 6} pour déterminer l’efficacité de la différenciation des DC par cytométrie en flux.
8. Collectez des BM-DC matures : Utilisez des élévateurs de cellules pour gratter doucement les DC des boîtes de Pétri. Recueillir toutes les suspensions cellulaires dans des tubes coniques de 50 ml. Centrifuger à 800 x g, pendant 5 min à 4 °C. Jeter le surnageant. Lavez les granulés cellulaires 3 fois avec 50 ml de PBS glacé. Enregistrez environ 2 x 10⁶ BM-DC pour l’analyse immunologique du phénotype par cytométrie en flux.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
10 fois le PBS	Fisher Scientific	BP3994	Tampon MACS
B6 fB-/- souris	Université de Floride centrale	En interne	Destinataires
N° B6. souris Ly5.1 (CD45.1 + )	Rivière Charles	546	Donateurs
souris BALB/c	Rivière Charles	28	Receveurs de greffe
C57BL/6 souris	Rivière Charles	27	Donateurs/bénéficiaires
Sérum fœtal bovin (FBS)	Système de R&D d’Atlanta Bilogicals	Réf. D17051	Culture cellulaire
Lipopolysacharide (LPS)	Millipore Sigma	L4391-1MG	DC mature
Incubateur Galaxy 170R du Nouveau-Brunswick	Eppendorf	Galaxy 170 R	Culture cellulaire
Pénicilline+streptomycinePénicilline/ Streptomycine (10 000 unités de pénicilline / 10 000 mg/ml de streptocoque)	GIBCO	Référence 15140	média
RPMI 1640	Thermo Fisher Scienctific	Référence 11875-093	média