Génération de cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse : une méthode pour générer des cellules dendritiques à partir de moelle osseuse de souris

1. Générer des cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse (BM-DCs).

1. Isoler la moelle osseuse des fémurs et des tibias de souris WT ou de facteur B (fB)^-/- sur le fond B6. Brièvement, prélevez le tibia et le fémur des deux jambes à l’aide de pinces et de ciseaux. Mettez-les dans un IPRP glacé contenant 1 % de FCS et 100 U/mL de pénicilline/streptomycine et 2 mM de L-glutamine (1 % RPMI) dans des tubes coniques de 50 mL. Nettoyez soigneusement le fémur et les os du tibia en enlevant tous les tissus musculaires à l’aide de pinces et de ciseaux. Transférez le fémur et le tibia des tubes coniques de 50 mL dans une boîte de Pétri de 92 mm de diamètre contenant 1 % de RPMI. À l’aide de ciseaux, coupez les extrémités du fémur ou du tibia. Remplissez un tube de 50 ml avec 25 ml de milieu RPMI 1640 à 1 %. Utilisez-le pour remplir une seringue de 3 ml attachée à une aiguille de 26 g avec 3 ml d’IPPM à 1 %. Insérez cette seringue dans l’os et poussez le piston pour évacuer la moelle osseuse (BM) de la cavité dans le tube de prélèvement avec 1 % RPMI (~3 mL/os). Faites tourner les cellules à 800 x g pendant 5 min.
2. Remettre la pastille en suspension dans 5 mL de tampon de lyse ACK pour la lyse des globules rouges. Incuber la suspension cellulaire pendant 5 min sur de la glace. Ajouter 10 mL de RPMI à 1 % dans la suspension cellulaire pour arrêter la lyse et centrifuger à 800 x g pendant 5 min à 4 °C. Jeter le surnageant.
3. Remettre les pastilles de cellules en suspension dans 10 mL de milieu de culture (RPMI 1640 contenant 10 % de FBS, 100 U/mL de pénicilline/streptomycine, 2 mM de l-glutamine et 50 mM de β-mercaptoéthanol) et ajuster le volume pour atteindre la concentration finale de 2 x 10⁶ cellules/mL.
4. Ajouter 20 ng/mL de facteur de stimulation des colonies de granulocytes et de macrophages (GM-CSF) à la suspension cellulaire. Cultivez les cellules de la moelle osseuse dans des boîtes de Pétri de 100 x 15 mm à 37 °C dans 5 % de CO₂ pendant 6 jours.
5. Remplacer la moitié du milieu de culture en cours (environ 5 ml) par un milieu frais contenant 40 ng/ml de GM-CSF le jour 3.
6. Préchauffez le milieu de culture dans un bain-marie à 37 °C. Prélevez environ 5 ml du milieu dans les boîtes de culture de moelle osseuse. Centrifuger à 800 x g pendant 5 min à 4 °C. Jeter le surnageant. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans un milieu de culture de 5 mL contenant 40 ng/mL DE GM-CSF.
7. Ajouter 25 μg/mL de lipopolysaccharide (LPS) dans le milieu au 6e jour de la culture pour faire mûrir les BM-DC. Conservez une aliquote de 2 x 10^{cellules 6} pour déterminer l’efficacité de la différenciation des DC par cytométrie en flux.
8. Collectez des BM-DC matures : Utilisez des élévateurs de cellules pour gratter doucement les DC des boîtes de Pétri. Recueillir toutes les suspensions cellulaires dans des tubes coniques de 50 ml. Centrifuger à 800 x g, pendant 5 min à 4 °C. Jeter le surnageant. Lavez les granulés cellulaires 3 fois avec 50 ml de PBS glacé. Enregistrez environ 2 x 10⁶ BM-DC pour l’analyse immunologique du phénotype par cytométrie en flux.