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1. Fixation, lyse cellulaire et cisaillement de la chromatine
REMARQUE : Les échantillons de patients et les cellules Jurkat sont fixés et lysés avec un kit ChIP disponible dans le commerce selon les instructions du fabricant, avec les modifications décrites précédemment. La fixation s’effectue sous une hotte à flux laminaire.
- Préparez un tube de 1,5 mL avec 1 mL de formaldéhyde à 37 %, un tube de 1,5 mL avec 1 mL de glycine 1,25 M, un tube de 5 mL avec 4 mL de 1x PBS et une boîte avec de la glace pour la fixation des cellules.
- Après avoir stimulé les cellules pendant le temps d’incubation respectif, stimulez les cellules en ajoutant 32,4 nM de phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) et 1 μM d’ionomycine. Incuber ensuite les cellules pendant 16 h à 37 °C et 5 % de CO2 avec le couvercle du tube ouvert (pour éviter toute contamination, un film d’étanchéité perméable à l’air peut être utilisé, essorer les tubes de 5 mL à 200 x g pendant 5 min et remettre les cellules en suspension dans 500 μL de PBS dans les tubes de 5 mL.
- Ajoutez 340 μM de formaldéhyde (13,5 μL de formaldéhyde à 37 %) dans les cellules. Après un bref mélange en pipetant soigneusement de haut en bas, incubez la suspension pendant 2,5 min (cellules Jurkat) ou 5 min (échantillon du patient) à température ambiante.
note: Un temps de fixation prolongé est nécessaire pour les cellules primaires afin d’assurer un cisaillement optimal.
- Ajouter 125 mM de glycine (57 μL de 1,25 M de glycine) pour arrêter la fixation et incuber pendant encore 5 min. Mettre les cellules sur de la glace immédiatement après et centrifuger à 500 x g pendant 5 min à 4 °C. Retirer le surnageant par aspiration.
- Laver les cellules deux fois avec 1 mL de PBS glacé à 200 x g pendant 5 min à 4 °C et retirer le surnageant à chaque fois par aspiration.
note: Après la fixation, le protocole peut être mis en pause. Les cellules fixes doivent être stockées à -80 °C. Pour tester, si l’épitope de l’anticorps destiné à être utilisé dans le protocole suivant n’est pas masqué par fixation, des échantillons supplémentaires peuvent être utilisés pour l’analyse par électrophorèse sur gel SDS-PAGE et Western blot. Ces étapes sont effectuées avec 100 μg de protéines selon les instructions du fabricant. Tous les anticorps αNFAT2 sont utilisés à une dilution de 1:1000, l’anticorps GAPDH à une dilution de 1:10000. La figure 1 montre un exemple d’échantillons fixés provenant de cellules Jurkat contenant des anticorps appropriés et inappropriés.
- Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 5 mL de tampon de lyse 1 disponible dans le commerce en pipetant de haut en bas. Ensuite, placez les échantillons sur la glace sur un shaker et incubez-les pendant 10 min en secouant.
note: Avant la lyse, les cellules peuvent être désintégrées pendant 10 s dans de l’azote liquide. Ceci est utile pour les cellules Jurkat, mais doit être évité dans les échantillons primaires de patients. Pour la désintégration, placez les tubes de 5 mL pendant 5 s dans 5 à 10 mL d’azote liquide dans un récipient spécifique. Portez des lunettes de sécurité et des gants de sécurité appropriés.
- Ensuite, centrifugez les tubes à 500 x g pendant 5 min à 4 °C et retirez soigneusement le surnageant par pipetage.
- Homogénéiser les cellules dans 5 mL de tampon de lyse 2 disponible dans le commerce en pipetant de haut en bas et incuber pendant 10 min sur de la glace tout en agitant. Ensuite, centrifugez les tubes à 500 x g pendant 5 min à 4 °C et retirez soigneusement le surnageant par pipetage.
- Remettez la pastille cellulaire en suspension dans 500 μL (cellules Jurkat) ou 140 μL (échantillons de patients) de tampon de cisaillement 1 contenant 1x inhibiteur de protéase (5 μL ou 1,4 μL, respectivement) et incubez le mélange pendant 10 min sur de la glace.
- Pour le cisaillement de la chromatine, transférez 140 μL de la suspension cellulaire de l’étape 1.9 dans des tubes sonicateurs (évitez de produire des bulles d’air et répétez cette étape si nécessaire en raison du volume de l’échantillon). Placez les tubes dans l’ultra-soniseur focalisé à une température de 7 °C et cisaillez pendant 10 min (lignée cellulaire) ou 7,5 min (échantillons de patients) avec une puissance incidente moyenne de 9,375 W pour obtenir des fragments d’ADN de 200 à 500 pb.
- Enfin, centrifuger à 15700 x g pendant 10 min à 4 °C dans la petite centrifugeuse et recueillir le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 mL.
- Pour vérifier la taille appropriée des fragments, analysez 20 μL de chromatine cisaillée par électrophorèse sur gel dans un gel d’agarose TBE à 1,5 %. La figure 2 montre une image exemplaire de la chromatine cisaillée à partir de cellules Jurkat de bonne et de mauvaise qualité. À ce stade, le protocole peut être potentiellement mis en pause. La chromatine cisaillée doit être conservée à -80 °C.
