Dosage de l’immunoprécipitation de la chromatine : une technique pour étudier les interactions protéine-ADN dans les cellules

Résumé

Source : Fuchs, A. R.,et al. A Chromatin Immunoprécipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocyte Leukemia. J. Vis. Exp. (2018).

Cette vidéo décrit le protocole de dosage par immunoprécipitation de la chromatine (ChIP), qui est une technique classique pour démontrer les interactions protéine-ADN. Cette technique est utilisée pour identifier les gènes cibles dans les cellules de leucémie lymphoïde chronique humaine.

Protocole

1. Immunoprécipitation de la chromatine

REMARQUE : L'immunoprécipitation de la chromatine a été réalisée avec un kit ChIP disponible dans le commerce selon les instructions du fabricant avec modifications.

1. Calculez le nombre d’immunoprécipitations (70 μL (cellules Jurkat) ou 15 μL (échantillons de patients) de chromatine cisaillée plus un anticorps) et préparez 20 μL de billes enrobées de protéine A par précipitation dans un tube de 1,5 mL. Lavez les billes dans 40 μL de 1x tampon ChIP 1 par précipitation en pipetant de haut en bas, laissez reposer les billes dans un support magnétique pendant 1 min et retirez le surnageant par pipetage. Effectuez cette étape quatre fois au total. Finalement, remettez les billes en suspension dans le volume d’origine avec 1x tampon ChIP 1.
2. Pour l’immunoprécipitation elle-même, utilisez 10 μg de l’anticorps αNFAT2 (7A6) pour capturer NFAT2 avec ses séquences cibles liées. Utilisez 2,5 μg d’un anticorps IgG de lapin (DA1E) comme contrôle IgG. Préparez les réactions dans des tubes frais de 1,5 mL comme indiqué dans le tableau 1.
   REMARQUE : Il est important d’utiliser un anticorps monoclonal de haute affinité dont l’épitope n’est pas masqué lors de la fixation pour ce protocole. Les anticorps polyclonaux introduisent un niveau de variation supplémentaire, ce qui rend beaucoup plus difficile l’interprétation appropriée des résultats reçus.
3. Incuber le mélange de l’étape 1.2 pendant la nuit à 4 °C sur une roue tournante à 6 tr/min.
4. Le lendemain, faites tourner les tubes pendant 5 s à 7 000 x g dans la petite centrifugeuse, incubez-les dans un rack magnétique pendant 1 min et retirez le surnageant par aspiration. Lavez les perles une fois avec chacun des tampons de lavage 1, 2, 3 et 4 consécutivement.
5. Pour ce faire, mettez les billes en suspension dans 350 μL de tampon de lavage et incubez-les pendant 5 min à 4 °C sur une roue tournante à 6 tr/min.
6. Ensuite, faites tourner les tubes pendant 5 s à 7000 x g dans la petite centrifugeuse. Ensuite, placez-les pendant 1 min dans une grille magnétique, retirez le surnageant et ajoutez le tampon de lavage suivant.
7. Après la dernière étape de lavage, retirer le surnageant par pipetage, prélever les billes dans 100 μL de tampon d’élution 1 et les incuber pendant 30 min sur une roue tournante à 6 tr/min.
8. Faites tourner les tubes brièvement (5 s à 7000 x g dans la petite centrifugeuse) et placez-les dans un rack magnétique pendant 1 min.
9. Transférez ensuite le surnageant par pipetage dans un nouveau tube de 1,5 mL et ajoutez 4 μL de tampon d’élution 2.
10. Pour créer le contrôle d’entrée, mélangez 1 μL de chromatine cisaillée avec 99 μL de tampon d’élution 1 et 4 μL de tampon d’élution 2 (dans cette configuration, il y a trois tubes par patient : un contrôle d’entrée, un contrôle IgG et un échantillon αNFAT2).
11. Incuber les échantillons pendant 4 h à 65 °C et 1300 tr/min dans un agitateur tubulaire de 1,5 mL. Ajouter 100 μL d’isopropanol à 100 %, vortex et faire tourner les échantillons pendant 5 s à 7000 x g dans la petite centrifugeuse.
12. Remettez en suspension les billes magnétiques disponibles en faisant un vortex complet, ajoutez 10 μL de billes à chaque échantillon et incubez pendant 1 h à température ambiante sur une roue rotative à 6 tr/min.
13. Après l’incubation, faites tourner les tubes pendant 5 s à 7000 x g dans la petite centrifugeuse et placez-les pendant 1 min dans un rack magnétique. Éliminer le surnageant par aspiration.
14. Remettre les billes en suspension dans 100 μL de tampon de lavage 1. Retournez les tubes pour mélanger et incubez pendant 5 min à température ambiante sur une roue tournante à 6 tr/min.
15. Faites tourner les tubes pendant 5 s à 7000 x g dans la petite centrifugeuse, placez-les pendant 1 min dans un rack magnétique et retirez le surnageant par pipetage. Répétez les étapes 2.13-2.14 avec le tampon de lavage 2.
16. Par la suite, retirer le tampon de lavage par aspiration, remettre les billes en suspension dans 55 μL du tampon d’élution et incuber pendant 15 min à température ambiante sur la roue tournante à 6 tr/min pour éluer l’ADN précipité. Enfin, faites tourner les tubes pendant 5 s à 7000 x g dans la petite centrifugeuse, placez-les pendant 1 min dans une grille magnétique et transférez le surnageant dans de nouveaux tubes de 1,5 mL.
    note: Ici, le protocole peut être potentiellement mis en pause. L’ADN élué doit ensuite être stocké à -20 °C.

article	volume (μL) par IP
5 % BSA	6
100 x inhibiteur de protéase	3
5 x tampon ChIP 1	56
Chromatine cisaillée	x (15 μL ou 70 μL)
Perles magnétiques recouvertes de protéine A	20
ChIP seq grade eau	185-x-y
anticorps (αNFAT2 ou contrôle IgG)	y (1,09 μL ou 1 μL)
total	270

Tableau 1 : Calendrier de pipetage de l’immunoprécipitation de la chromatine. L’immunoprécipitation de la chromatine a été réalisée en préparant les réactions comme indiqué dans le tableau.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Anticorps anti-NFAT2	Alexis	1008505	Clone 7A6
Anticorps anti-NFAT2	Signalisation cellulaire	LE 8032S	Clone D15F1
Anticorps anti-NFAT2 de grade ChIP	Abcam	AB2796	Clone 7A6
Rack magnétique, aimant DynaMag-15	Thermo Scientific	12301D	Peut être remplacé par des instruments similaires
Kit iDeal ChIp-seq pour Histones	Diagenode	C01010059
Petite centrifugeuse	Thermo Scientific	Fresque d’Hérée 17	Peut être remplacé par des instruments similaires
Agitateur Duomax 1030	Heidolph Instruments	Tél. : 543-32205-00	Peut être remplacé par des instruments similaires
Cocktail d’inhibiteurs de protéase et de phosphatase Halt (100X)	Thermo Scientific	Référence 78440
IRDye 680LT Donkey anti-Rabbit IgG (H + L), 0,5 mg	LI-COR Biosciences	Référence 926-68023
IRDye 800CW Chèvre anti-Souris IgG (H + L), 0,1 mg	LI-COR Biosciences	Référence 925-32210
Tube DNA LoBind 1,5 mL	Eppendorf	22431021
FBS supérieur	Merck	Réf. S0615
37 % de formaldéhyde par an, ACS	Roth	4979,1
1 x PBS	Sigma Aldrich	D8537
M220 Ultrasoniseur focalisé	Covaris	500295
20X Bolt MES SDS Tampon de fonctionnement	Thermo Scientific	B0002
Solution saline tamponnée Tris (TBS-10X)	Signalisation cellulaire	#12498
Dispositif de transfert de gel iBlot 2	Thermo Scientific	IB21001
Piles de transfert iBlot 2, nitrocellulose, taille normale	Thermo Scientific	Réf. B23001
grande centrifugeuse	Eppendorf	Référence 5804R	Peut être remplacé par des instruments similaires