Culture et récolte de clones HSPC : une méthode pour obtenir les clones HSPC triés individuellement

Résumé

Source : Huber, A. R., et al. Caractérisation de la charge mutationnelle et de la composition clonale du sang humain. J. Vis. Exp. (2019).

Cette vidéo décrit le protocole permettant d’isoler les HSPC de la moelle osseuse et de les trier à l’aide d’une technique de tri cellulaire activée par fluorescence, qui est une méthode permettant d’obtenir des HSPC triées individuellement. Nous cultivons ces cellules triées pour obtenir des clones de HSPC.

Protocole

1. Isolation, tri et culture HSPC

1. Faites tourner à 1–2 x 10⁷ cellules mononucléées pendant 5 min à 350 x g et remettez en suspension dans 50 μL de tampon FACS. Remettre la pastille cellulaire en suspension dans 100 μL de solution de coloration anti-CD3 (dilution 1:100 de l’anticorps anti-CD dans le tampon FACS). Transférez les cellules dans un tube de microcentrifugation.
   REMARQUE : Lors du tri avec >2 x 10⁷ cellules, augmentez le mélange d’anticorps et les volumes de tampon FACS en conséquence.
2. Préparez 50 μL de mélange de coloration HSC 2x selon la recette indiquée dans le tableau 1
3. Mélangez 50 μL de solution cellulaire avec le mélange de coloration HSC préparé et incubez les cellules pendant 15 min à température ambiante (RT) ou pendant 1 h sur de la glace pour que les anticorps se lient.
4. Laver les cellules en ajoutant 1 mL de tampon FACS et de pastille par centrifugation pendant 5 min à 350 x g.
5. Remettez les cellules en suspension dans 300 μL de tampon FACS et filtrez la suspension cellulaire à travers un tube de polystyrène de 5 mL recouvert d’une crépine de cellules de 35 μm pour éliminer les amas cellulaires avant le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS).
6. Préparez 25 mL de milieu de culture HSPC, composé de 1 milieu SFEM complété par 100 ng/mL de SCF, 100 ng/mL de Flt3, 50 ng/mL de TPO, 10 ng/mL d’IL-3, 20 ng/mL d’IL-6 et 100 ng/mL de formulation d’antibiotique (voir le tableau des matériaux).
7. Remplissez une plaque de culture cellulaire de 384 puits avec 75 μL de milieu de culture HSPC dans chaque puits.
   REMARQUE : Pour éviter l’évaporation du milieu dans les puits extérieurs, remplissez les puits extérieurs avec 75 μL d’eau stérile ou de PBS, et n’utilisez pas ces puits pour le tri cellulaire.
8. Tri des HSPC individuels
   1. Définissez des vannes pour le tri HSPC sur la base d’un contrôle non coloré (CSH triées individuellement) et de 10 000 cellules de l’échantillon coloré. Un résultat représentatif pour la pose de portes est illustré à la figure 1. Gate single cells en traçant une porte autour de la fraction linéaire de hauteur FSC en fonction de la fraction de surface FSC. Utilisez la fraction de contrôle non colorée pour dessiner la porte pour la fraction ^de lignage. Dessinez des portes pour les cellules CD34⁺ et caractérisez davantage ce sous-ensemble en définissant une porte spécifique pour les cellules CD38 ^- CD45RA^.
   2. Chargez la plaque à 384 puits sur la machine FACS et triez les cellules individuelles.
      REMARQUE : Si cela s’applique à la machine FACS, activez l’option permettant de conserver les données de tri d’index pour permettre le retraçage des cellules triées.
9. Culture de CSH triées individuellement
   1. Transférez directement la plaque à 384 puits dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 5 % de CO₂.
      note: Pour éviter l’évaporation pendant la culture, enveloppez la plaque de culture à 384 puits (avec couvercle) dans une pellicule de polyéthylène transparente.
   2. Conservez la plaque à 384 puits dans l’incubateur pendant 3 à 4 semaines jusqu’à ce que des clones visibles apparaissent. Des images représentatives de la culture clonale sont illustrées à la figure 2. En fonction de l’état du matériau d’entrée, 5 à 30 % des cellules triées se développeront par clonage.

anticorps	volume [μL]
BV421-CD34	5
Mixage FITC-Lineage (CD3/14/19/20/56)	5
PE-CD38	deux
APC- CD90	0,5
PerCP/Cy5.5 - CD45RA	5
PE/Cy7- CD49f	1
FITC -CD16	1
FITC-CD11	5
Tampon FACS	25,5

Tableau 1 : Mélange de tri HSC.Le tableau montre les dilutions des anticorps utilisés pour trier les CSH.

2. Récolte des clones HSPC

1. Après 4 semaines de culturation, déterminez quels puits ont une confluence de 30 % ou plus.
2. Pré-remplissez (pour chaque excroissance clonale) des microtubes de 1,5 mL avec 1 mL de BSA à 1 % dans du PBS et étiquetez le tube en fonction du puits correspondant.
3. Prémouiller une pointe de pipette avec 1 % de BSA dans du PBS pour minimiser le nombre de cellules collant à la pointe de la pipette.
4. Effectuez une pipette vers le haut ou vers le bas dans le puits avec une pipette de 200 μL (réglée à 75 μL) et raclez le fond du puits pour détacher les cellules dans le puits, et collectez la suspension cellulaire dans le microtube étiqueté correspondant au puits.
5. Prélever 75 μL de BSA frais à 1 % dans du PBS et répéter le pipetage dans le puits pour assurer une absorption maximale des cellules.
   REMARQUE : Les cellules cultivées par clonage peuvent coller au fond du puits. Inspectez les puits à l’aide d’un microscope à lumière inversée standard pour vous assurer que toutes les cellules ont été collectées.
6. Si tous les puits avec une confluence de >30 % ont été récoltés, remettez la plaque de 384 puits dans l’incubateur. Les cultures clonales peuvent proliférer jusqu’à 5 semaines.
7. Faites tourner la suspension cellulaire pendant 5 min à 350 x g. Une petite pastille doit être visible.
8. Retirer avec précaution tout le surnageant, sauf environ 5 μL. Les granules cellulaires peuvent être congelées à -20 °C et stockées pendant plusieurs mois avant d’être isolées de l’ADN.

Résultats

Figure 1 : Organigramme illustrant la procédure expérimentale basée sur le matériel d’entrée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
CD11c FITC	BioLégende	301603	Clone 3.9
CD16 FITC	BioLégende	302005	Clone 3G8
CD3 BV650	BioLégende	300467	Cloner UCHT1
CD34 BV421	BioLégende	343609	561
CD38 PE	BioLégende	303505	Cloner HIT2
CD45RA PerCP/Cy5.5	BioLégende	304121	Clone HI100
CD49f PE/Cy7	BioLégende	313621	Clone GoH3
CD90 APC	BioLégende	328113	Clone 5E10
Filtre cellulaire tube de 5 mL	Corning	352235
Plaque CELLSTAR, 384w, 130 μL, fond F, TC, couvercle	Greiner	781182
Ligand Flt3 humain, qualité supérieure	Miltenyi Biotech	Tél. : 130-096-479	Reconstitution dans des aliquotes à usage unique (25 μL) à 100 μg/mL dans de la BSA à 0,1 % dans le PBS
IL-3 recombinante humaine (E. coli-exprimé)	Technologies des cellules souches	Référence 78040.1	Reconstitution dans des aliquotes à usage unique (2,5 μL) à 100 μg/mL dans de la BSA à 0,1 % dans le PBS
IL-6 recombinante humaine (E. coliexprimed)	Technologies des cellules souches	Référence 78050.1	Reconstitution dans des aliquotes à usage unique (5 μL) à 100 μg/mL dans de la BSA à 0,1 % dans le PBS
SCF humain, qualité supérieure	Miltenyi Biotech	Tél. : 130-096-695	Reconstitution dans des aliquotes à usage unique (25 μL) à 100 μg/mL dans de la BSA à 0,1 % dans le PBS
TPO humain, qualité supérieure	Miltenyi Biotech	Tél. : 130-095-752	Reconstitution dans des aliquotes à usage unique (12,5 μL) à 100 μg/mL dans 0,1 % de BSA dans du PBS
Lignée (CD3/14/19/20/56) FITC	BioLégende	348701	Clones : UCHT1, HCD14, HIB19, 2H7, HCD56
Pbs			Fabriqué dans les installations de l'Institut. Le PBS disponible dans le commerce peut également être utilisé
Primocin	Invivogen	ANT-PM-1	Formulation de l’antibiotique