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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
Isolement des cellules c-Kit+ de la moelle osseuse
- Sacrifiez les souris selon les directives institutionnelles.
REMARQUE : Ici, les souris ont été exposées au dioxyde de carbone (CO2) selon le débit recommandé par l’AVMA jusqu’à ce que la mort soit déterminée par l’arrêt de la respiration et du rythme cardiaque, suivi d’une luxation cervicale.
- Récoltez les os des pattes de la souris - deux fémurs, deux tibias, deux iliaques. Nettoyez tous les tissus des os en grattant avec un scalpel. Mettez les os de la jambe dans du froid 1x PBS sur de la glace - 5 ml dans un tube de 15 ml. Versez le contenu du tube dans un mortier et écrasez-le avec un pilon.
- À l’aide d’une pipette, filtrez la suspension cellulaire à travers une crépine de 70 μm dans un tube à bouchon à vis de 50 mL avec une pipette de 10 mL. Lavez le mortier et le pilon plusieurs fois avec du PBS froid, en recueillant et en ajoutant une suspension cellulaire dans le tube de 50 ml. Essorer la moelle osseuse à 1 200 x g à 4 °C pendant 5 min. Retirez le surnageant à l’aide d’un aspirateur à l’aide d’une pipette en verre. Suspendre la pastille de cellule dans 5 mL de 1x PBS à l’aide d’une pipette.
- À l’aide d’une pipette, ajoutez lentement de la moelle osseuse suspendue dans le haut de 5 mL de polysaccharose à température ambiante (la température est critique), en prenant grand soin de ne pas perturber l’interface. Faites tourner à 400 x g à température ambiante pendant 20 min avec le frein desserré.
- Prélever l’interface de la cellule mononucléaire totale trouble (TMNC) à l’aide d’une pipette et la placer dans un nouveau tube de 15 ml. Porter le volume à 10 mL avec 1x PBS pour le lavage, en prenant 20 μL pour compter, et essorer à 1 200 x g à 4 °C pendant 5 min. Jetez le surnageant et conservez la pastille sur de la glace pour l’étape 4.6.1.
- Effectuez l’isolement des cellules c-Kit+.
- Suivez le protocole d’un kit de microbilles pour l’isolement des cellules c-Kit+. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 80 μL de 1x PBS + EDTA + BSA à 107 cellules. À la suspension cellulaire, ajoutez 20 μL de CD117 MicroBeads / 107 cellules au total. Bien mélanger par vortex et incuber pendant 10 min à 4 °C. Porter le volume à 10 mL en ajoutant 1x PBS + EDTA + BSA et essorer à 1 200 x g à 4 °C pendant 5 min.
- Retirer le surnageant par le vide et suspendre la pastille cellulaire dans 500 μL/108 cellules totales dans 1x PBS + EDTA + BSA. À l’aide du support magnétique avec la colonne magnétique attachée, ajoutez 3 ml de 1x PBS + EDTA + BSA et laissez-le s’écouler par gravité dans un tube de collecte de 15 ml.
- Une fois que le premier ajout de tampon a fini de traverser la colonne, ajoutez la suspension cellulaire à la colonne, en lui permettant de s’écouler par gravité dans le tube de collecte de 15 ml. Ce flux est la fraction cellulaire indésirable.
- Lavez la colonne 3 fois avec 3 mL 1x PBS + EDTA + BSA à chaque fois, en lui permettant de s’écouler par gravité dans le tube de collecte. Retirez la colonne de l’aimant et placez-la sur le dessus d’un tube de 15 ml.
- Ajoutez 5 mL de 1x PBS + EDTA + BSA et rincez-le immédiatement avec le piston fourni avec la colonne. Retirez le piston et répétez le rinçage avec 5 ml supplémentaires de 1x PBS + EDTA + BSA. Comptez les cellules dans le volume total à l’aide de méthodes standard.
- Faites tourner les cellules à 1 200 x g à 4 °C pendant 5 min. Retirez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans de l’IMDM complet (IMDM + 10 % FBS + IL-6 [10 ng/mL] + mSCF [50 ng/mL] + ligand FLT3 [20 ng/mL] + IL-3 [10 ng/mL]) pour la culture. Cultivez ces cellules pendant la nuit dans 2 x 106 cellules/1 mL de milieu complet IMDM cellulaire en les plaçant dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO2.