Transduction à médiation rétrovirale : une méthode pour introduire un gène cible dans des cellules cancéreuses

Résumé

Source : Kesarwani, M., et al. Méthodes d’évaluation du rôle de c-Fos et Dusp1 dans la dépendance oncogène. J. Vis. Exp. (2019).

Cette vidéo décrit le protocole de validation génétique par transfert de gènes cibles à l’aide de rétrovirus dans des lignées cellulaires de leucémie myéloïde chronique. Les rétrovirus agissent comme médiateur pour transférer le matériel génétique dans la cellule leucémique par le biais d’un processus appelé transduction, qui permet l’expression à long terme du gène cible. Cette méthode peut être appliquée à n’importe quelle cellule cible pour la validation génétique et le développement thérapeutique.

Protocole

1. Transduction

1. Transfection de plasmides rétroviraux
   1. Décongelez fraîchement les cellules HEK293 l’après-midi précédent dans un bain-marie réglé à 37 °C. Faites tourner le cryotube contenant les cellules HEK à 435 x g à température ambiante pendant 3 min. Retirez le surnageant via un vide et suspendez la pastille cellulaire dans 1 mL de DMEM complété par 10 % de FBS, de la pénicilline, de la streptomycine et de la glutamine.
   2. Comptez les cellules et ajoutez le volume approprié dans une boîte traitée de 10 cm (~4 x 10,⁶ HEK293T cellules). Ajoutez 14 ml du média DMEM 10 dans le plat et mélangez bien en le faisant glisser de haut en bas pour une répartition égale. Placez le plat dans un incubateur à 37 °C, 5 % de CO₂ pendant la nuit.
   3. Le lendemain matin, vérifiez la confluence des cellules à l’aide d’un microscope à lumière inversée (50 % ou plus fonctionne bien).
   4. Combinez l’ADN (plasmide rétroviral souhaité), le PclEco (plasmide d’emballage), 2 M CaCl₂ et H₂0 dans un tube de 1,5 mL (= 500 μL) à l’aide d’une micropipette dans les quantités suivantes : 7,5 μg d’ADN (BCR-ABL1-YFP), 7,5 μg de pCLeco, 62 μL de 2 M de CaCl₂ et de l’eau jusqu’à un volume final de 500 μL. Ajouter 500 μL de 2x HBS dans un autre tube de 1,5 mL.
   5. Ajouter le mélange d’ADN goutte à goutte dans le tube de 1,5 mL contenant 500 μL de 2x HBS (280 mM de NaCl, 100 mM HEPES et 1,5 mM de Na₂HPO₄) pendant le mélange. Pour ce faire, réglez un vortex à la vitesse la plus basse et maintenez le tube HBS dessus pour un mélange constant tout en ajoutant le mélange de transfection.
   6. Laissez le mélange de transfection incuber pendant 20 à 30 minutes à température ambiante. Pendant l’incubation, ajoutez 25 nM de chloroquine aux cellules HEK et remettez-les dans l’incubateur. Après l’incubation, ajoutez le mélange de transfection goutte à goutte dans les cellules HEK, puis faites tourner doucement le média pour mélanger le mélange de transfection dans toute la plaque.
   7. Incuber les cellules avec le mélange pendant ~8 h dans un incubateur à 37 °C, 5 % de CO₂. Changez le milieu de ces cellules en ajoutant très lentement 14 ml de milieu DMEM 10 frais. Le pipetage lent contre la paroi de la boîte permet d’éviter tout décapage des cellules HEK. Incuber les cellules pendant la nuit dans l’incubateur à 37 °C, 5 % de CO₂.
   8. Prélever le surnageant viral à l’aide d’une seringue de 10 mL, aspirer le surnageant dans la seringue et fixer le filtre de la seringue de 0,45 μm. Plongez le surnageant viral dans un nouveau tube de prélèvement. Prendre la première collection de surnageant viral ~16 h plus tard.
2. Concentration virale de fibronectine et transduction
   1. Ajouter 2 ml d’un fragment de fibronectine humaine recombinante de 0,1 mg dans 1x PBS dans des plaques de culture à 6 puits non traitées. Préparez autant de fibronectine que nécessaire, ce qui dépend du nombre de cellules et de génotypes. Un puits peut transduire suffisamment 10 millions de cellules c-Kit+. Incuber la plaque pendant une nuit à 4 °C.
   2. Le lendemain, retirez la fibronectine des puits à l’aide d’une pipette, pipetez 2 mL de BSA stérile à 2 % dans 1x PBS pour bloquer la plaque, et incubez pendant 30 min à température ambiante. Retirez le BSA à l’aide d’un aspirateur et lavez-le soigneusement en pipetant 2 mL de 1x PBS, puis retirez-le à l’aide d’un aspirateur.
   3. Ajouter immédiatement un surnageant viral fraîchement recueilli et filtré (à 0,45 μm) jusqu’à 5 mL. Centrifugeuse à 435 x g à 32 °C pendant 2 h. Retirez le surnageant à l’aide d’un aspirateur et répétez cette étape avec du surnageant viral supplémentaire fraîchement collecté et essorez à nouveau. Retirer le surnageant à l’aide d’un aspirateur et laver les puits en ajoutant 2 mL de 1x PBS ; Ensuite, retirez-le à l’aide d’un aspirateur.
   4. Ajoutez les cellules de souris c-Kit+ qui ont été cultivées pendant la nuit en faisant tourner les cellules et en remettant la pastille en suspension dans un IMDM complet, pour la culture. Cultivez ces cellules pendant la nuit dans 2 x 10⁶ cellules/1 mL de milieu complet IMDM cellulaire en les plaçant dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO₂) jusqu’aux puits enrobés viraux en mélangeant bien les suspensions cellulaires et en les pipetant dans la plaque de fibronectine concentrée maintenant virale. Essorage à 1 200 x g à 25 °C pendant 90 min. Placez les cellules dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO2.
   5. 48 h après la transduction, granuler les cellules par centrifugation à 1 200 x g à 4 °C pendant 5 min et les remettre en suspension dans le tampon FACS #1 (1x PBS + 0,5 % BSA) à 6 x 10⁶/mL. Déterminez le pourcentage de cellules BCR-ABL1 positives en mesurant le pourcentage de YFP positives à l’aide de la cytométrie en flux.
   6. Acquérir des événements à l’aide de la procédure standard. Tout d’abord, gate les cellules vivantes en fonction de la diffusion directe et latérale. Ensuite, grille les cellules vivantes YFP positives à l’exclusion des cellules YFP-négatives déterminées par le contrôle négatif (Figure 1).

Résultats

Figure 1 : FACS montrant la fréquence des cellules YFP+ dans le sang d’une souris transplantée et d’une souris WT (contrôle négatif). Les panneaux supérieurs montrent un nuage de points des cellules et du point de contrôle. Les panneaux inférieurs montrent les histogrammes de YFP par rapport à la diffusion latérale. Les cellules avec un IMF de >10

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
DMEM	Cellgro (corning)	15-013-CV
Fragment de fibronectine humaine recombinante RetroNectin	Takara	T100B
FBS	Atlanta biologique	Réf. S11150
Penn/Streptocoque	Cellgro (corning)	30-002-CI
L-Glutamine	Cellgro (corning)	Référence 25-005-CL	5 mg/mL de stock dans l’eau
HEPES	sigma	N° H7006
Pbs	Corning	21040CV
Na2HPO4.7H2O	sigma	S9390
Chlorure de calcium	Invitrogen	K278001
2x HBS	Invitrogen	K278002
Edta	Ambion	AM9261
Bsa	sigma	A7906
Culture humaine à long terme initiant un essai cellulaire	Technologies de cellules temporaires
Compteur de cellules automatisé TC-10	Bio-RAD
ROSACreERT2/c-Fos fl/fl Dusp1-/-	Fabriqué en interne
ROSACreERT2/c-Fosfl/fl	Fabriqué en interne
ROSACreERT2	Laboratoire Jackson
C57Bl/6	Laboratoire Jackson
CML-CD34+ et cellules CD34+ normales	Hôpital universitaire, Université de Cincinnati
LSR II (analyseur FACS)	Bd
Fortessa I (analyseur FACS)	Bd
FACSAriaII (Trieur FACS)	Bd
Incubateur CO2 série NAPCO 8000 WJ	Thermo scientifique
Rotor à godets pivotants cetrifuge 5810R	Eppendorf
1/2 cc Seringue à insuline Lo-Dose u-100 28 G1/2	Becton Dickinson	Becton Dickinson
Hémisuccinate d’hydrocortisone sodique	Technologies des cellules souches	Référence 7904
GM-CSF	Prospec	CYT-221
G-SCF	Prospec	CYT-220
IL-3 humaine	Prospec	CYT-210
SCF humain	Prospec	CYT-255
Érythropoïéine	Amgen	Référence 5513-267-10
BD Perm/Wash (solution de perméabilisation et de lavage pour flux de phospho)	Bd	554723
BD Cytofix/Cytoperm (solution de fixation et de perméabilisation)	Bd	554714
BD Pharm Lyse	Bd	555899
Étoile de cellules en nylon de 70 μm	Becton Dickinson	Référence 352350
Filtre à disque acro 0,45 μM	drap mortuaire	2016-10