Dosage de l’UFC à base de méthylcellulose : une méthode pour déterminer l’effet des composés anticancéreux sur la formation de colonies dans les cellules leucémiques

Résumé

Source : Kesarwani, M., et al. Méthodes d’évaluation du rôle de c-Fos et Dusp1 dans la dépendance oncogène. J. Vis. Exp. (2019).

Cette vidéo décrit le protocole de l’unité de formation de colonies à base de méthylcellulose ou test UFC, qui permet d’identifier et de compter le nombre de colonies formées par les cellules leucémiques en réponse au traitement avec des composés anticancéreux.

Protocole

1. Dosages unitaires formant colonies

1. Décongeler la méthylcellulose avec les cytokines pour souris à température ambiante pendant 1 à 2 h. Aliquote 3 mL de méthylcellulose dans un tube FACS à l’aide d’une seringue de 5 mL sans aiguille. Triez les cellules YFP-positives sur un trieur de cellules.
2. Faites tourner les cellules vers le bas et suspendez la pastille dans un milieu complet IMDM. Comptez les cellules à mettre en plaque et diluez-les pour obtenir 5 000 cellules YFP-positives dans 100 μL de milieu complet IMDM.
3. Ajouter 100 μL de la suspension cellulaire contenant 5 000 cellules positives au YFP et les inhibiteurs appropriés à 3 mL de méthylcellulose. Vortex à puissance élevée pour mélanger pendant 10 à 30 s.
4. Une fois que la plupart des bulles d’air se sont échappées, utilisez une seringue de 1 ml pour déposer 1 ml de média en trois plaques de 3 cm en éjectant le support d’un côté et en inclinant lentement la plaque dans un mouvement circulaire pour l’étaler uniformément.
5. La concentration finale des inhibiteurs à utiliser est l’imatinib à 3 μM, le DFC à 0,2 μM et le BCI à 0,5 μM, seuls ou en combinaison. Le cas échéant, supprimer le c-Fos en enrobant les cellules de 4-hydroxytamoxifène (1 μg/mL) ajouté à la méthylcellulose.
6. Après le dressage, placez les assiettes dans une grande boîte de Pétri avec un plat ouvert contenant 2 ml d’eau stérile au milieu. Couvrez la grande boîte de Pétri et incubez soigneusement dans l’incubateur à 37 °C, 5 % de CO₂. Enregistrez le nombre de colonies après une semaine de placage en comptant le nombre total de colonies au microscope.
7. Analysez quelques colonies de plaques appropriées pour la délétion de c-Fos par PCR. Récupérez les colonies en les suçant avec une pointe P1000. Délogez les cellules dans 500 μL de 1x PBS en lavant l’embout dans le PBS plusieurs fois. Faites tourner les suspensions cellulaires à 6 000 x g pendant 1 min et extrayez l’ADN de la pastille cellulaire à l’aide d’un kit d’isolement d’ADN génomique.
8. Utilisez l’ADN génomique pour la PCR à l’aide des amorces mFos-FP3 et mFos-RP5. Analysez les produits PCR sur un gel d’agarose à 2 % et une image à l’aide d’un système de documentation sur gel.
9. Pour une présentation graphique des colonies, colorez les colonies à l’aide de chlorure d’iodonitrotétrazolium. Dissoudre 10 mg de chlorure d’iodonitrotétrazolium dans 10 mL d’eau pour obtenir une solution à 1 mg/mL. Stérilisez la solution à l’aide d’un verrou Luer avec un filtre de 0,2 μm fixé à une seringue de 10 ml dans des conditions stériles dans une hotte de culture tissulaire.
10. Dans le capot de culture tissulaire, ajouter 100 μL de solution de coloration goutte à goutte autour de la plaque d’UFC ; en prenant soin de ne pas glisser ou de déranger les colonies. Incuber les plaques pendant la nuit dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C, 5 % de CO₂. Les colonies deviendront brun rougeâtre foncé. À l’aide d’un fond blanc dans le capot de culture de tissus stériles, prenez des photos de la plaque UFC colorée.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
IMDM	Cellgro (corning)	15-016-CVR
MethoCult GF M3434 (Méthylcellulose pour UFC de souris)	cellule souche	Référence 3434
4-Hydroxytamoxifène	sigma	N° H6278
SCF murin recombinant	Prospec	CYT-275
Ligand Flt3 murin recombinant	Prospec	CYT-340
IL-6 murin recombinant	Prospec	CYT-350
IL-7 murin recombinant	Peprotech	217-17
DFC	Laboratoires LKT Inc.	D3420
Le	Chemzon Scientific	NZ-06-195
L’imatinib	LC Laborator	I-5508
1x PBS	Cellgro (corning)	Référence 21-040-CV
1/2 cc Seringue à insuline Lo-Dose u-100 28 G1/2	Becton Dickinson	329461
Chlorure d’iodonitrotétrazolium	sigma	I10406
Instruments
Incubateur CO2 série NAPCO 8000 WJ	Thermo scientifique
Rotor à godets pivotants cetrifuge 5810R	Eppendorf
C-1000 Thermocycleur	Bio-RAD
ChemiDoc Imaging System (système d’imagerie pour gels et Western blots)	Bio-RAD	17001401
souris
ROSACreERT2	Laboratoire Jackson
ROSACreERT2/c-Fos fl/fl Dusp1-/	Fabriqué en interne
ROSACreERT2/c-Fosfl/fl	Fabriqué en interne