Sélection immunomagnétique négative : une méthode pour purifier les lymphocytes B des cellules mononucléées du sang périphérique

Résumé

Source : Serra S. et al. Essai basé sur HPLC pour surveiller le métabolisme extracellulaire des nucléotides/nucléosides dans les cellules de leucémie lymphoïde chronique humaine. J. Vis. Exp. (2016)

La vidéo explique une façon de purifier les lymphocytes B par ciblage immunomagnétique et séparation de la suspension de cellules mononucléées du sang périphérique. La méthode consiste à marquer des types de cellules indésirables avec des anticorps ou des ligands spécifiques (liés à des particules magnétiques) ciblant des protéines de surface cellulaire spécifiques, à appauvrir de la suspension cellulaire hétérogène par séparation magnétique.

Protocole

1. Purification des lymphocytes B leucémiques par isolement négatif

1. Mettre en suspension 10 à⁷ PBMC/ml dans du PBS 0,1 % d’albumine sérique bovine (BSA) 2 mM d’EDTA, pH 7,4 (tampon d’isolement).
2. Ajouter 10 μg d’anticorps primaires monoclonaux anti-CD3, -CD14 et -CD16 de souris pour 10^{à 7} cellules et incuber pendant 30 min à 4 °C.
3. Laver les cellules avec le tampon d’isolement et centrifuger à 500 x g pendant 5 min à 4 °C.
4. Remettre les cellules en suspension dans le tampon d’isolement à 10⁷ PBMC/ml.
5. Avant l’incubation avec les cellules, remettre en suspension des billes magnétiques IgG anti-souris de mouton dans le flacon. Transvasez 100 μl de billes par 10⁷ cellules dans un tube.
6. Ajouter 1 mL de tampon d’isolement et placer le tube dans un support magnétique pendant 1 min. Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette de 5 ml.
7. Retirez le tube de l’aimant et remettez en suspension les billes lavées dans 100 μl de tampon d’isolement.
8. Incuber 10^{à 7} cellules avec 100 μl de billes magnétiques pendant 30 min à 4 °C avec une inclinaison et une rotation douces.
9. Placez le tube dans le support d’aimant pendant 2 min et transférez le surnageant avec les cellules CD19⁺/CD5⁺ non liées dans un tube frais avec une pipette de 5 ml.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Sang humain
anti-CD3 purifié, -CD14, -CD16	Fabriqué en interne		souris monoclonale
Dynabeads mouton anti-souris IgG	Invitrogen	Référence 11031
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)	Amresco	E404-200TABS	Comprimés
albumine sérique bovine (BSA)	Biographie de l’ID	1000 à 70	Qualité standard
tampon d’isolement			PBS 0,1 % BSA 2 mM EDTA, pH 7,4
Aimant DynaMag-15	Invitrogen	12301D	Séparateur de billes magnétiques Dynal