Métabolisme extracellulaire des purines : un test basé sur la HPLC pour mesurer la génération d’adénosine et le métabolisme dans les cellules leucémiques

Résumé

Source : Serra S et al. Essai basé sur la HPLC pour surveiller le métabolisme extracellulaire des nucléotides/nucléosides dans les cellules de leucémie lymphoïde chronique humaine. J. Vis. Exp. (2016)

Cette vidéo explique une méthode de chromatographie liquide quantitative à haute performance en phase inverse (RP-HPLC) pour mesurer le métabolisme de l’adénosine et des purines associées générées par la consommation d’AMP dans l’environnement extracellulaire des cellules cancéreuses leucémiques. Le protocole décrit un test RP-HPLC sensible, spécifique, fiable et reproductible, développé et validé pour la quantification des nucléotides et des nucléosides extracellulaires de la purine produits par des cellules de leucémie lymphoïde chronique (LLC) purifiées dans différentes conditions de culture.

Protocole

1. Préparation des solutions étalons et mères inhibitrices

1. Pour préparer l’AMP, pesez 0,00345 g d’AMP et dissolvez-le dans 5 ml de milieu sans sérum pour obtenir une solution étalon de 2 mM d’AMP.
2. Pour préparer l’ADO, peser 0,00265 g d’ADO et le dissoudre dans 5 ml de milieu sans sérum pour obtenir une solution étalon de 2 mM d’ADO.
3. Pour préparer l’INO, peser 0,00268 g d’INO et le dissoudre dans 5 ml de milieu sans sérum pour obtenir une solution étalon de 2 mM d’INO.
4. Préparez une solution à 400 μM d’AMP, d’ADO et d’INO en mélangeant 1 ml de la solution mère à 2 mM dans 4 ml de milieu sans sérum (5 ml de volume final).
   1. Procéder à une dilution 1:4 de chaque solution étalon de 400 μM pour obtenir une concentration de 100 μM en pipetant 500 μl de la solution 400 μM dans 1 500 μl de milieu exempt de sérum (volume final de 2 ml).
   2. Préparer des dilutions en série de chaque composé dans un milieu sans sérum pour obtenir les concentrations suivantes : 100 μM - 50 μM - 25 μM - 10 μM - 5 μM - 2,5 μM - 1 μM - 0,5 μM - 0,25 μM.
      Remarque : Par exemple, pipeter 1 ml de la solution à 100 μM dans 1 ml de milieu sans sérum (dilution 1:2) pour obtenir une concentration de 50 μM et procéder aux dilutions restantes.
5. Préparer une solution mère de 10 mM d’APCP dissoute dans du PBS, aliquote et mère à - 30 °C.
6. Préparer des solutions mères de 10 mM de chlorhydrate d’EHNA, de dCF et de dipyridamole dissous dans du sulfoxyde de diméthyle (DMSO), aliquote et bouillon à -30 °C.

2. Programmer la méthode HPLC

1. Préparez un tampon d’acétate d’ammonium de 7 mM en dissolvant 0,770 g d’acétate d’ammonium dans 2 L d’eau double désionisée (tampon A). Ajuster au pH 3,0 avec de l’acide chlorhydrique.
2. Préparez une bouteille en verre contenant au moins 2 L d’acétonitrile ultra-pur pour HPLC (tampon B) et connectez la colonne de garde et la colonne au HPLC.
   Remarque : Les colonnes et les tampons sont à RT pendant l’utilisation.
3. Connectez-vous au logiciel HPLC et sélectionnez le bouton « Parcourir le projet ». Allez dans le menu « fichier » et sélectionnez « nouvelle méthode » puis « méthode de l’instrument ».
4. Programmez la méthode de la colonne d’équilibrage selon le tableau 1. Réglez un débit de 1,00 ml/min et programmez le détecteur UV pour qu’il lise à 260 nm. Enregistrez la méthode de l’instrument et sélectionnez à nouveau « nouvelle méthode » dans le menu « fichier » puis « ensemble de méthodes ». Choisissez la méthode d’instrument précédemment enregistrée et enregistrez le jeu de méthodes actuel du même nom.
5. Répétez l’étape 2.3 pour programmer la méthode d’échantillonnage indiquée dans le Tableau 2. Réglez un débit de 1,00 mL/min et programmez le détecteur UV pour qu’il lise à 260 nm. Enregistrez la méthode de l’instrument et répétez la même procédure que celle décrite à l’étape 4.4 pour enregistrer l’ensemble de méthodes.
6. Sélectionnez le bouton « exécuter les échantillons », choisissez « nouvelle méthode de jeu d’échantillons » dans le menu « fichier ».
7. Sélectionnez l’option « vide » et entrez le numéro du flacon (dans l’échantillonneur automatique), le nom de l’échantillon, le volume d’injection (50 μl). Sélectionnez l’ensemble de méthodes enregistré précédemment dans la colonne « ensemble de méthodes » et entrez le temps d’exécution total (min).
   Remarque : Entrez la méthode de la colonne d’équilibrage (tableau 1) dans la colonne « ensemble de méthodes » avant chaque cycle d’échantillonnage et entrez le temps total de traitement (min).

3. Génération d’une courbe d’étalonnage standard pour chaque composé

1. Injecter 50 μl de blanc (milieu spécifique exempt de sérum, qui ne contient pas d’adénosine désaminase) et de chaque échantillon étalon en suivant les méthodes décrites dans les tableaux 1 et 2.
   1. Utilisez la méthode de la colonne d’équilibrage (tableau 1) avant chaque analyse d’échantillon et définissez les conditions de gradient décrites dans le tableau 2 pour obtenir une séparation adéquate des pics. Reportez-vous au tableau 3 pour les temps de rétention signalés de l’AMP, de l’ADO et de l’INO dans ces conditions HPLC.
   2. Déterminez la surface de crête de l’AMP, de l’ADO et de l’INO à différentes concentrations en choisissant le bouton « processus » dans le logiciel HPLC et ensuite l’option « intégrer ». Vous pouvez également sélectionner manuellement les points de départ et d’arrivée de chaque pic.
   3. Tracer les zones de pics en fonction de la concentration nominale de chaque étalon pour obtenir la courbe d’étalonnage en neuf points (100, 50, 25, 10, 5, 2,5, 1, 0,5, 0,25 μM).
   4. Calculez l’équation d’une droite pour AMP, ADO et INO : y = mx + b,<br /> où x est la concentration en μM et y correspond à l’aire du pic.

   Heure	Débit (ml/min)	%A	%B
   	1,00	100	0
   1,24	1,00	100	0
   6,22	1,00	deux	98
   18,65	1,00	deux	98

   Tableau 1 : Méthode de la colonne d’équilibration. Représentation schématique des changements de solvant pour l’équilibrage de la colonne. Tampon A : 7 mM d’acétate d’ammonium, pH 3,0. Tampon B : acétonitrile.

   Heure	Débit (ml/min)	%A	%B
   	1,00	0	100
   3,74	1,00	0	100
   13,71	1,00	15	85
   17.00	1,00	100	0
   20.00	1,00	100	0

   Tableau 2 : Exécuter la méthode d’échantillonnage. Représentation schématique des changements de solvant pour la mesure HPLC des composés puriques. Tampon A : 7 mM d’acétate d’ammonium, pH 3,0. Tampon B : acétonitrile.

   	Temps de rétention	λmax
   ampère	8 h 00 min	260
   Ino	11 h 00 min	260
   Ado	11 min 90 s	260

   Tableau 3 : Temps de rétention des composés puriques. Temps de rétention typiques observés pour l’AMP, l’ADO et l’INO. Le détecteur UV est programmé pour lire à 260 nm.

   4. Prétraitement avec les inhibiteurs et incubation avec le substrat (AMP)

   1. Pour tester la consommation d’AMP, la génération d’ADO et d’INO sans inhibition des transporteurs de CD73, d’ADA et de nucléosidiques, remettre en suspension les cellules de LLC purifiées 2 x 10⁶ CD19⁺/CD5⁺ dans 250 μl de milieu sans sérum et de cellules sur plaque dans une plaque à 48 puits (ou dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml).
   2. Ajouter 250 μl d’AMP 400 μM ou d’inhibiteurs d’AMP plus pour obtenir une concentration finale de 200 μM AMP. Inclure une condition en l’absence du substrat à utiliser comme échantillon blanc.
   3. Incuber de 30 à 60 min à 37 °C.
   4. À la fin de la période d’incubation, recueillir 500 μl de surnageants dans des tubes de microcentrifugation froids (sur glace) et centrifuger immédiatement à 17 000 x g à 4 °C pendant 5 min.
   5. Transférez les surnageants dans de nouveaux tubes de microcentrifugation de 1,5 ml et stockez-les immédiatement à -80 °C ou procédez à la préparation des échantillons pour les cycles HPLC.

   5. Préparation des échantillons pour HPLC

   1. Filtrez les surnageants dans de nouveaux tubes de microcentrifugation de 1,5 ml avec les filtres à seringue de 0,2 μm. Utilisez des seringues de 1 ml pour le filtrage.
   2. Si le système HPLC est équipé d’un échantillonneur automatique, préparez les flacons en verre pour la HPLC et utilisez les micro-inserts de 0,1 ml pour les petits volumes d’échantillon.
   3. Transvasez au moins 100 μl d’échantillon dans le flacon en verre à l’aide d’une micropipette ou d’une pipette Pasteur en verre. Attention à transférer sans bulles et refermer le flacon avec le bouchon à vis.
   4. Les échantillons sont maintenant prêts pour l’analyse par RP-HPLC.

   6. Mesures HPLC des purines

   1. Sélectionnez le bouton « exécuter les échantillons » ; choisissez « nouvelle méthode de jeu d’échantillons » dans le menu « fichier ».
   2. Sélectionnez l’option « vide » et indiquez : le numéro du flacon (dans l’échantillonneur automatique), le nom de l’échantillon, le volume d’injection (50 μl).
   3. Sélectionnez la méthode de colonne d’équilibrage et la méthode d’échantillonnage décrite dans le Tableau 1 et le Tableau 2, respectivement, pour tous les essais à vide et les échantillons suivants.
      note: Définissez la méthode de la colonne d’équilibrage (Tableau 1) avant chaque échantillonnage.
   4. Injecter 50 μl de blanc (milieu sans sérum) et de chaque échantillon.
   5. Déterminer la concentration de purines dans chaque échantillon, quantifier l’AMP, l’ADO et l’INO en obtenant les zones de pic aux temps de rétention décrits dans le tableau 3.
      1. Sélectionnez le bouton « traiter » puis l’option « intégrer ». Vous pouvez également choisir manuellement les points de départ et d’arrivée de chaque pic pour obtenir la mesure de surface. Cela se fait en traçant une ligne entre les points de début et d’arrivée du pic.
      2. Déterminez la concentration en μM en appliquant l’équation obtenue pour la courbe standard : y = mx + b, où x représente la concentration en μM et y est l’aire du pic mesurée à partir de l’échantillon inconnu.
         REMARQUE : La figure 1 donne un exemple de la courbe standard d’étalonnage ADO : x = (aire y - 981,02)/40026
   6. Considérant que 2 x 10^{cellules 6} ont été remises en suspension dans 0,500 ml de milieu, calculer les μmoles d’AMP, d’ADO et d’INO consommées et/ou produites par 10 cellules de 6 cellules de^la LLC en appliquant la proportion suivante :
      μmoles : 1 000 ml = x μmoles : 0,250 ml
      note: Les μmoles dans 1 000 ml (nombre de μmoles dans 1 L) de sont équivalents à la concentration en μM et x sont les μmoles de nucléotide ou de nucléoside produites par 10⁶ cellules. Enfin, convertissez les μmoles en nmoles consommés et/ou produits par 10⁶ cellules LLC : nmoles = μmoles x 1 000

Résultats

Graphique 1.Génération d’une courbe standard interne.Courbe standard d’étalonnage représentative pour ADO et l’équation relative obtenue. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
AIM V sérum sans sérum moyen	GIBCO	Référence 12055-091	Liquide (qualité recherche)
adénosine 5'-monosphate (AMP)	Sigma-Aldrich	A1752
adénosine (ADO)	Sigma-Aldrich	A9251
inosine (INO)	Sigma-Aldrich	I4125
acétonitrile (CHROMASOLV Plus)	Sigma-Aldrich	Référence 34998	De qualité HPLC
acétate d’ammonium	Sigma-Aldrich	Référence 9688	7 mM, pH 3,0
Flacons à filetage court	VWR	Référence 548-0029	1,5 ml/verre
Micro-inserts	VWR	Référence 548-0006	0,1 ml/verre
Bouchons à vis	VWR	Référence 548-0085	9 mm/PP bleu
Colonne Atlantis dC18	eaux	186001344	5 μm, 4,6 mm x 150 mm
Colonne de garde Atlantis dC18	eaux	186001323	5 μm, 4,6 mm x 20 mm
Module de séparation Waters Alliance 2965	eaux		Module de séparation HPLC
Waters 2998 Détecteur à réseau de photodiodes (PDA)	eaux		Détecteur UV
Logiciel Waters Empower2	eaux