Isolement de cellules T-ALL marquées par fluorescence : une méthode pour isoler des cellules T-ALL d’un poisson-zèbre adulte

Résumé

Source : Pruitt, M. M., et al. Isolement de la population latérale dans la leucémie lymphoblastique aiguë à cellules T induite par Myc chez le poisson zèbre. J. Vis. Exp. (2017).

Ce protocole décrit la technique d’isolement des cellules tumorales de leucémie aiguë lymphoblastique à cellules T marquées par fluorescence (LAL-T) d’un poisson-zèbre adulte et de leur quantification à l’aide d’un colorant bleu trypan.

Protocole

1. Collection de cellules T-LAL marquées par fluorescence à partir du poisson tumoral primaire

1. Préparez au moins 20 ml de sérum fœtal bovin inactivé à 10 % par la chaleur dans une solution saline tamponnée à 0,9 fois le phosphate (FBS/PBS).
2. Ajouter 1 mL de FBS/PBS dans un flacon de sel d’héparine sodique (300 unités).
3. Sélectionnez des poissons porteurs de tumeurs dans plus de 50 % du corps, ou ceux qui ont des difficultés à manger ou à nager. Sacrifiez le poisson en le surdosant avec de la tricaïne ou en l’immergeant dans de l’eau glacée. Confirmer la mort par l’absence de mouvement des branchies et de battement cardiaque.
4. Utilisez une lame de rasoir pour retirer la tête du poisson.
5. Lavez la cavité du poisson avec la solution d’héparine pour éliminer l’excès de globules rouges.
   1. À l’aide d’une pipette, injecter 100 μL de solution d’héparine (ajouter 1 mL de FBS/PBS dans un flacon de sel d’héparine sodique) dans la cavité corporelle du poisson. Retirez tout le liquide qui s’écoule (il contiendra des cellules sanguines) et pipetez-le dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml.
   2. Utilisez une nouvelle pointe de pipette pour laver à nouveau le corps. Effectuez au moins trois lavages, ou jusqu’à ce que le liquide qui se répand semble exempt de sang.
   3. Jetez tout le liquide des lavages lors de ces étapes, car il ne sera pas utilisé dans d’autres analyses.
6. Prélever les cellules leucémiques.
   1. Injectez 100 μL de FBS/PBS dans la cavité corporelle du poisson.
   2. Appliquez une légère pression sur l’extérieur du corps du poisson avec la pointe de la pipette pour presser/pousser les cellules tumorales.
      note: Si cette étape est effectuée à l’aide d’un microscope à dissection, les cellules tumorales qui s’échappent de la cavité corporelle seront évidentes.
   3. Recueillir le liquide et les cellules de chaque lavage dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml.
   4. Répétez les étapes 1.6.1-1.6.3 jusqu’à ce que la plupart des cellules tumorales soient collectées (généralement 5 à 10 fois). Collectez toutes les cellules tumorales dans le même tube de microcentrifugation de 1,5 ml. Conservez les cellules à température ambiante.
7. Mélangez les cellules tumorales collectées à l’étape précédente en les pipetant doucement pour dissocier les amas de cellules. Filtrez la suspension cellulaire à travers un filtre à mailles de 40 μm. Lavez le filtre 1 à 2 fois avec 100 μL de FBS/PBS. Conservez les cellules à température ambiante.
8. Mélanger 2 μL de suspension cellulaire avec 18 μL de bleu de trypan (0,4 %, dilué 1:10 et filtré) dans un nouveau tube. Chargez 10 μL sur un hémocytomètre et comptez le nombre de cellules fluorescentes vivantes (non bleues) pour calculer le nombre de cellules tumorales isolées.
   note: Les cellules GFP négatives non bleues sont probablement des cellules T normales et non malignes et ne doivent pas être comptées. Au moins 2 x 10⁶ cellules sont nécessaires pour colorer les cellules avec Hoechst 33342.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Poisson-zèbre syngénique (CG2)			Voir Mizgireuv et al., 2006
Plasmide rag2 :C-myc			Laboratoire Langenau
rag2 :Plasmide GFP construit dans le laboratoire de Jong			promoteur rag2 du Laboratoire Langenau
plasmide pCS2-transposase			Laboratoire Chien
Microscope SteREO Discovery V8	Microscopie Carl Zeiss	Référence 495015-0008-000
Méthanesulfonate de tricaïne (MS-222)	Western Chemical, Inc	Fisher Scientific - NC0342409	100 grammes
Sérum fœtal bovin (FBS)	HyClone Laboratories, Inc.	Fisher Scientific - SH3007103	500 ml
Saline tamponnée au phosphate (PBS)	Gibco par Life Technologies	Référence 1001-023	pH 7,4 (1x) - 500 mL
Sel d’héparine sodique	Sigma-Aldrich	Référence 2106	15 à 300 flacons d’unités
Filtre à mailles de 40 μm	Marque Falcon Corning	Référence 352340	Caisse de 50
Trypan bleu	Sigma Sciences de la Vie	Réf. T8154	20 mL - Solution (0,4 %)