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1. Coloration des cellules T-ALL marquées par fluorescence avec Hoechst 33342 pour identifier la population latérale
- Diluer Hoechst 33342 1:10 avec du H2O sans nucléase pour obtenir une concentration de travail de 1 mg/mL. Conservez le colorant à 4 °C et dans l’obscurité.
- Préparez une solution de 100 mM de vérapamil en dissolvant 49,1 mg dans 1 mL de diméthylsulfoxyde (DMSO).
note: Le vérapamil est un inhibiteur des transporteurs ABC et constitue un contrôle important pour les expériences sur les populations latérales. L’ajout de vérapamil aux échantillons inhibera la capacité des transporteurs ABC à évacuer le colorant Hoechst 33342. Par conséquent, une véritable population latérale disparaîtra lorsque le vérapamil sera ajouté à l’échantillon.
- Réglez un bain-marie à 28 °C.
- Préparez des échantillons et des contrôles dans l’obscurité en ajoutant des cellules et des solutions dans des tubes de trieur de cellules activés par fluorescence (FACS).
- Préparez les échantillons en ajoutant 106 cellules, 15 μL de 1 mg/mL de Hoechst 33342 et 2,5 μL de DMSO dans un tube FACS. Réglez le volume à 1 ml avec FBS/PBS.
- Préparez les témoins en ajoutant 106 cellules, 15 μL de 1 mg/mL de Hoechst 33342 et 2,5 μL de 100 mM de vérapamil dans un tube FACS. Réglez le volume à 1 ml avec FBS/PBS.
note: Un minimum de 106 cellules/échantillon est recommandé, mais il est préférable de colorer plus de cellules, surtout si les cellules de la population latérale seront triées pour une analyse plus approfondie. Ne pas dépasser 106 cellules/mL et maintenir la concentration de Hoechst 33342 à 15 μg/mL. Si 10 x 106 cellules sont colorées, le volume total de réaction est de 10 ml.
- Incuber dans un bain-marie à 28 °C dans l’obscurité pendant 120 min.
- Après l’incubation, placez immédiatement les cellules sur de la glace et conservez-les dans l’obscurité.
- Granulez les cellules à 4 °C pendant 6 min à 300 x g. Retirez le surnageant. Laver avec 1 mL de FBS/PBS.
- Granulez les cellules à 4 °C pendant 6 min à 300 x g. Retirez le surnageant. Remettre les cellules en suspension dans 1 mL de FBS/PBS.
- Conserver à 4 °C jusqu’au tri des cellules.
- 15 min avant le tri cellulaire, ajouter 2 μL d’iodure de propidium (1 mg/mL) à chaque 1 mL de FBS/PBS (concentration finale : 2 μg/mL). Bien mélanger.
2. Utilisez FACS pour trouver la population latérale dans la population de cellules T-ALL marquées par fluorescence
- Analysez les suspensions de cellules T-ALL colorées du poisson-zèbre sur un trieur de cellules équipé d’un laser UV pour l’excitation du colorant Hoechst 33342 et d’un laser de 488 nm pour l’excitation PI et pour la détection des cellules GFP+ T-ALL.