1. Préparation de la culture cellulaire et montage expérimental
- Conserver les cellules cancéreuses du côlon humain, HCT-116 comme recommandé par le fournisseur, en monocouches dans des flacons deculture de 75 cm contenant 10 ml de McCoy's 5a Medium Modified formulé, complété par 10 % de sérum bovin fœtal et 1 % de solution antimycosique antibiotique.
- Cultivez les cellules dans un environnement humidifié à 5 % de CO2 à 37 °C jusqu’à une confluence de 70 % avec renouvellement moyen tous les 2 à 3 jours.
- Pour obtenir l’effet du faisceau BNCT (p. ex., faisceau de neutrons plus BPA) et du BNCT qui tue les cellules cancéreuses sous forme de particules lourdes et dépose la majeure partie de leur énergie dans les cellules cancéreuses contenant du bore, la veille de l’irradiation, ajoutez l’agent d’administration du bore au milieu de culture cellulaire – par exemple, 10BPA, 4-Borono-L-phénylalanine (10 μg 10B/mL, 0,925 mM final) 12–16 h (absorption maximale de bore) avant l’irradiation.
note: Si vous utilisez une autre lignée cellulaire, pour laquelle il n’existe pas de données dans le cas de l’étude BNCT, testez l’absorption de bore pour chaque lignée cellulaire afin d’obtenir une concentration optimale de bore. Mesurer l’absorption cellulaire du BPA par spectroscopie d’émission optique à plasma à couplage inductif (ICP-OES) comme réalisée par le groupe Dagrosa.
- Après 12-16 h d’administration de bore, aspirer le milieu et laver les cellules avec 10 mL de 1x PBS. Ensuite, essayez les cellules en ajoutant 2 ml de solution de trypsine-EDTA aux cellules et incubez pendant 5 min à 37 °C pour favoriser le détachement cellulaire. Lorsque les cellules commencent à se détacher, arrêtez l’action de la trypsine en ajoutant 10 ml de milieu complet.
- Aspirer la suspension cellulaire dans le tube de 15 mL et compter les cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisé en ajoutant 10 μL de bleu de trypan à 0,4 % à 10 μL de cellules, mélanger et aliquoter 10 μL sur une lame de comptage. Diluer la suspension cellulaire à une concentration de 1 x 106 cellules/mL du milieu. Aliquote 1 mL de suspension cellulaire par cryotube.
- Préparez des dosimètres thermoluminescents (TLD) pour la mesure des doses de rayons gamma et des feuilles d’or pour les fluences neutroniques et fixez les TLD sur les cryotubes ou le ballon de culture cellulaire avant l’irradiation.
- Irradier les 1 x 106 cellules/mL avec le faisceau mixte de neutrons à un flux de neutrons thermiques minimal recommandé de 5,9 x 1011 (n/cm-2 min-1)4 dans des flacons de culture ou des cryotubes, selon les capacités de l’installation.
note: Réglez le temps d’irradiation avant d’obtenir le flux de neutrons recommandé.
- Après l’irradiation, ensemencer 1 mL de cellules irradiées (1 x 106 cellules/mL) sur des lamelles de 22 x 22 mm dans des boîtes de Pétri de 35 mm ou des plaques à 6 puits, compléter avec 2 mL de milieu requis. Incuber les cellules pendant un maximum de 3 h à 37 °C dans un environnement humidifié à 5 % de CO2 pour les laisser se fixer aux lamelles. Observez de temps en temps la fixation des cellules sous un microscope inversé avec objectif 20x.
note: Pour les cellules HCT-116, la densité minimale est de 600 000 cellules à ensemencer. Pour une procédure de coloration ultérieure rapide, utilisez des lames de chambre, réduisez la densité cellulaire en conséquence.
2. Fixation des cellules
- Après l’irradiation et l’incubation des cellules, retirez le milieu des cellules attachées et lavez les cellules une fois avec 2,5 ml de PBS.
- Fixez les cellules avec 1 mL d’éthanol à 70 % pendant 10 min à RT.
note: Alternativement, utilisez du paraformaldéhyde (PFA) à 1 % à 3,7 % pour la fixation, comme recommandé précédemment. Le protocole est en pause ici. Conservez les cellules fixées dans de l’éthanol dans un congélateur à -20 °C pendant quelques semaines au maximum pour une analyse plus approfondie et une coloration par immunofluorescence.
3. Perméabilisation des cellules
- Après la fixation, retirez l’éthanol de la boîte de Pétri et lavez-le avec 2,5 ml de 1x PBS.
note: Ne laissez pas les cellules sécher entre les étapes de rinçage.
- Ajouter délicatement 1 ml de 0,2 % de Triton X-100/PBS pour couvrir les lamelles avec des cellules dans des boîtes de Pétri.
- Incuber pendant 5 min à RT.
- Laver les cellules 3 fois avec 2,5 ml de 1 PBS.
note: Augmenter le pourcentage de Triton X-100 dans le PBS jusqu’à 0,5 % si nécessaire (plus de foyers détectables, en fonction de la lignée cellulaire testée). Effectuez des lavages supplémentaires avec du PBST (PBS avec 0,5 % de Tween) pour éviter les grippages non spécifiques.
- Bloquer l’étape de perméabilisation avec 1 mL de BSA (Bovin Serum Fraction V albumine) dilué dans du PBS et incuber pendant un minimum de 30 min ou 1 h avec 1 % de BSA.
note: Cette étape peut être omise et dépend du type d’anticorps utilisé. Vous pouvez également utiliser 5 % de FBS comme recommandé.
4. Coloration par immunofluorescence
- Ajouter la quantité appropriée d’anticorps primaires (anti-ɣ-H2AX, anti-DNA-PKcs et anti-Rad52) diluée dans du PBS avec BSA (2 % d’albumine sérique bovine de fraction V) comme recommandé (voir le tableau 1 avec les dilutions recommandées) (100 μL sont nécessaires par échantillon).
| Anticorps primaire | fonction | Dilution recommandée | Stockage [°C] |
| Anti-ɣ-H2AX | détection des DNA-DSB | 1:1000 (PBS-BSA) | 4 |
| Anti-ADN-PKcs | détection de RIF de la protéine DNA-PKcs appartenant à NHEJ | 1:200 (PBS-BSA) | -20 |
| Anti-Rad52 | détection de RIF de la protéine Rad52 appartenant à HRR | 1:200 (PBS-BSA) | -20 |
| Anticorps secondaires | | Dans le noir | |
| anti-souris IgG FITC | Foyers ɣ-H2AX | 1:400 (PBS-BSA) | 4 |
| Chèvre Anti-Lapin IgG H&L (Alexa Fluor 488) | pour les foyers des protéines de réparation NHEJ et HRR | 1:500 (PBS-BSA) | -20 |
Tableau 1 : Dilutions recommandées et notes pour l’utilisation des anticorps utilisés dans la section
- Couvrir la boîte de Pétri pour maintenir l’humidité dans une boîte en plastique avec de la lignine hydratée à l’aide d’eau distillée et incuber pendant 30 min à 37 °C dans l’incubateur.
note: Le protocole peut être mis en pause ici. L’incubation peut être effectuée à 4 °C pendant la nuit.
- Après l’incubation, effectuer 3 lavages avec 2,5 mL de PBS.
note: Ne laissez pas la lame sécher pendant les étapes de rinçage.
- Ajouter la quantité appropriée d’anticorps secondaires (IgG anti-souris FITC, IgG anti-lapin de chèvre (Alexa Fluor 488) diluée dans du PBS avec BSA (voir tableau 1) (100 μL est nécessaire par échantillon). Pour cette étape et les suivantes, travaillez dans l’obscurité.
- Couvrez à nouveau la boîte de Pétri pour maintenir l’humidité dans une boîte en plastique avec de la lignine hydratée et incubez pendant au moins 30 minutes à 37 °C dans l’incubateur.
- Après l’incubation, effectuez 3 lavages avec 2,5 ml de PBS.
- Ajouter 100 μL de DAPI dilué dans du PBS à une concentration finale de 1 μg/mL pour contre-colorer les noyaux.
- Incuber brièvement pendant un maximum de 2 min à RT.
- Après l’incubation, effectuez 3 lavages avec 2,5 ml de PBS.
- Retirez le PBS et placez délicatement une lamelle sur le dessus du support de montage, en évitant la formation de bulles d’air, et scellez les bords de la lamelle avec du vernis à ongles. Attendez que le vernis sèche et peignez la lamelle autour.
- Attendre le durcissement du support de montage (jusqu’à 3 h) avant l’analyse de l’image en microscopie à fluorescence.
note: Le protocole peut être mis en pause ici. Conservez les lames de verre dans une boîte en plastique à 4 °C dans l’obscurité.
