Détection des ROS avec coloration DCFH-DA : mesure des ROS totaux dans les lignées cellulaires du cancer colorectal

Résumé

Source : Kim, H., et al. Détection des espèces réactives totales de l'oxygène dans les cellules adhérentes par coloration au diacétate de 2',7'-dichlorodihydrofluorescéine. J. Vis. Exp. (2020).

Cette vidéo décrit le protocole de détection des espèces réactives de l'oxygène (ROS) cellulaires totales à l'aide du diacétate de 2',7'-dichlorodihydrofluorescéine (DCFH-DA). Cette méthode permet de visualiser la localisation des ROS dans les cellules adhérentes à l’aide d’un microscope à fluorescence et de quantifier davantage l’intensité des ROS à l’aide d’un lecteur de plaques de fluorescence.

Protocole

1. Ensemencement cellulaire

1. Ensemencer 2 x 10⁵ cellules cancéreuses colorectales HCT116 par puits dans une plaque de 24 puits et maintenir les cellules dans le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) pendant la nuit à 37 °C.
2. Remplacer le milieu de culture par ou sans milieu contenant 100 μM de sulfate ferreux (FS) ou 10 μM de doxorubicine (DOX) et incuber pendant 24 h.

2. Préparation de la solution DCFH-DA

1. Dissoudre 4,85 mg de DCFH-DA dans 1 mL de sulfoxyde de diméthyle (DMSO) pour obtenir une solution mère de 10 mM.
2. Diluez la solution mère avec du DMEM préchauffé dans une solution de travail de 10 μM juste avant de l’ajouter dans les puits.
3. Vortex la solution de travail pour 10 s.

3. Coloration DCFH-DA

1. Retirez le milieu contenant le médicament et lavez-le une fois avec du DMEM.
2. Ajouter 500 μL de la solution de travail DCFH-DA dans chaque puits et incuber à 37 °C pendant 30 min.
3. Retirez la solution de travail DCFH-DA. Laver une fois avec du DMEM et 2x avec 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
4. Ajouter 500 μL de 1x PBS dans chaque puits.

4. Acquisition d’images et mesure d’intensité

1. Prenez des images fluorescentes représentatives pour chaque puits à l’aide du canal de la protéine fluorescente verte (GFP) sur un microscope à fluorescence.
2. Après avoir pris des images, retirez le PBS et ajoutez 200 μL de tampon de test de radio-immunoprécipitation (RIPA) dans chaque puits.
3. Incuber sur de la glace pendant 5 min, puis recueillir le lysat cellulaire dans des tubes de 1,5 mL.
4. Centrifugeuse à 21 130 x g pendant 10 min à 4 °C.
5. Transférez 100 μL du surnageant sur une plaque noire à 96 puits et mesurez l’intensité de la fluorescence à l’aide d’un lecteur de microplaques à fluorescence à une longueur d’onde d’excitation de 485 nm et à une longueur d’onde d’émission de 530 nm.
6. Transférez 1 μL du surnageant dans une plaque transparente à 96 puits contenant 100 μL de solution de dosage protéique 1x pour mesurer la concentration en protéines à l’aide du test Bradford.
7. Normalisez les intensités de fluorescence avec les concentrations de protéines.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Diacétate de 2',7'-dichlorofluorescéine	Cayman Chemical, Ann Arbor, MI	Référence 20656
Chlorhydrate de doxorubicine	TCI America, Portland, OR	D4193-25MG
Aigle modifié de Dulbecco Medium	Corning, État de New York	Réf. 45000-304
Système d’imagerie automatique Invitrogen EVOS FL	Thermo Fisher Scientific Waltham, Massachusetts	AMAFD1000	ou tout autre microscope à fluorescence
Dosage des protéines Solution de Bradford	Bio-Rad, Hercules, Californie	5000001
Lecteur de microplaques SpectraMax M2	Dispositifs moléculaires, Radnor, Pennsylvanie	Référence 89429-532	ou tout autre lecteur de microplaques à fluorescence
Sulfate ferreux heptahydraté	VWR, Radnor, Pennsylvanie	Référence 97061-542