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Toutes les procédures impliquant des animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Culture de lignées cellulaires
- Cultivez des cellules HK dans un milieu RPMI-1640 complet complété par 10 % de sérum de veau fœtal, 2 nM de glutamine, 100 U/mL de pénicilline G et 100 mg/mL de streptomycine à 37 °C dans un incubateur humidifié à 5 % de CO2.
note: Les cellules HK sont des cellules dendritiques folliculaires humaines normales et peuvent être cultivées et développées pendant ≤ 15 passages in vitro.
2. Marquage et enrichissement des tumeurs marquées à la luciférase
- Implantez les tumeurs directement dans les flancs gauche et droit de souris femelles NOD/SCID âgées de 6 à 8 semaines.
- Mesurez la croissance tumorale toutes les deux semaines à l’aide d’un pied à coulisse numérique.
- À 1 cm de diamètre, transduisez la tumeur. Injecter directement dans la tumeur une dose unique de lentivirus Luc/red fluorescent protein (RFP) (50 μL/tumeur, dilution 1:30 à partir d’un stock concentré de lentivirus à titre élevé) à l’aide d’une seringue de 1 cc avec une aiguille de 27 G.
note: La tumeur du patient atteint généralement 1 cm de diamètre en 1 à 2 mois. Cependant, le taux de croissance est extrêmement variable et basé sur un certain nombre de facteurs, notamment le grade et le type de tumeur.
3. Modèle de souris CRC
- Anesthésier une souris mâle de six à huit semaines avec de l’isoflurane (2,5 % dans 100 % d’oxygène, 1 L/min) dans la chambre d’induction. Confirmez la sédation par un pincement de l’orteil.
- Placez la souris anesthésiée en position couchée sous un microscope à dissection, en veillant à fixer son museau à un cône nasal d’isoflurane et ses membres avant avec du ruban adhésif pour plus de stabilité.
note: Les loupes peuvent être utilisées à la place d’un microscope à dissection. Un petit objet peut être utilisé pour améliorer la visibilité et l’angle lorsqu’il est placé sous la base de la queue, élevant l’anus. En règle générale, de petites sections de gaze sont enroulées en forme de cylindre de 1 pouce de diamètre.
- Dilater le canal anal à l’aide d’une pince incurvée, lubrifiée à bout émoussé pour exposer la muqueuse distale, anale et rectale. Retirez les excréments.
- À l’aide d’une aiguille amovible stérile de 30 G sur une seringue en verre de 50 μL, injectez 10 μL de cellules tumorales marquées à la luciférase et de cellules HK (remettre en suspension 10 μL de cellules tumorales par souris pour le modèle CRC dans un milieu RPMI complet) dans la sous-muqueuse rectale postérieure distale, à 1 à 2 mm au-dessus du canal anal. Le biseau de l’aiguille doit être recouvert de muqueuse. Attention à ne pas passer dans la cavité pelvienne.
- Retirez la souris du cône nasal de l’isoflurane. Observez-le pendant 1 h en suivant la procédure. Recherchez des signes de détresse, c’est-à-dire le dos voûté, une respiration laborieuse, etc.
4. Imagerie bioluminescente
- Surveillez chaque semaine la charge métastatique primaire de la tumeur, du foie et des poumons à l’aide d’un système d’imagerie bioluminescente pour l’activité de la luciférase.
- Obtenez une expérience CRC sur la souris et pesez-la. Injectez 150 mg/kg de luciférine par voie intrapéritonéale et attendez 5 min que le substrat circule dans le corps de la souris.
- Anesthésier la souris avec 2,5 % d’isoflurane dans 100 % d’oxygène, 1 L/min dans la chambre d’induction.
- Placez la souris dans un appareil d’imagerie BLI avec le nez fixé dans le cône nasal. Lors de l’exposition pour l’image, assurez-vous que la zone d’intérêt fait face à l’appareil photo. Pour l’injection de CCR, la face ventrale doit faire face à la caméra pour chaque image. Imagez la souris en position couchée.