Établir des cultures primaires de fibroblastes adultes à partir de rongeurs

Résumé

Cet article décrit un protocole pour l'isolement et l'entretien des cultures de fibroblastes primaires de la peau et les tissus pulmonaires de rongeurs sauvages.

Résumé

L'importance de l'utilisation de cellules primaires, plutôt que de lignées cellulaires de cancer, pour des études biologiques est de plus largement reconnu. Les cellules primaires sont préférés dans les études sur le contrôle du cycle cellulaire, l'apoptose, et la réparation de l'ADN, les cellules cancéreuses sont porteurs de mutations dans les gènes impliqués dans ces processus. Les cellules primaires ne peuvent pas être cultivées indéfiniment en raison de l'apparition de la sénescence réplicative ou aneuploidization. Ainsi, de nouvelles cultures doivent être établis régulièrement. La procédure d'isolement de fibroblastes embryonnaires de rongeurs bien établie, mais d'isoler des cultures de fibroblastes adultes représente souvent un défi. Fibroblastes de rongeurs adultes isolés de modèles murins de maladies humaines peut être un contrôle préféré quand on les compare à des fibroblastes provenant de patients humains. Par ailleurs, les fibroblastes adultes sont les seuls matériaux disponibles lorsque vous travaillez avec des rongeurs sauvages où les femmes enceintes ne peuvent pas être obtenus facilement. Ici nous fournissons un protocole pour l'isolement et la culture de fibroblastes adultes de la peau des rongeurs et des poumons. Nous avons utilisé cette procédure avec succès pour isoler les fibroblastes de plus de vingt espèces de rongeurs à partir des souris de laboratoire et des rats à des rongeurs sauvages tels que le castor, le porc-épic et l'écureuil.

Protocole

1. Avant de partir

1. Stériliser des ciseaux et des pinces à l'éthanol 70%.
2. Placer les petits agitateur magnétique dans un bécher 30 mL, couvrir avec deux couches de papier d'aluminium, et autoclave.
3. Préparer un 28 unités Wunsch / ml de solution stock Libérase Blendzyme 3 dans l'eau stérile. Faire aliquotes de 0,5 ml et congeler à -20 ° C. Dégeler une aliquote de nouvelles avant chaque utilisation. La solution peut paraître nuageux après décongélation. Vortex la solution jusqu'à ce qu'elle devienne claire.
4. Réchauffez les milieux de culture cellulaire.

2. Préparation des échantillons d'animaux

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Discussion

Normale fibroblastes primaires fournissent une excellente alternative aux établie lignées cellulaires de cancer dans la recherche biologique. Un avantage important des fibroblastes est qu'ils ne portent des mutations dans les oncogènes et suppresseurs de tumeur et de maintenir intactes les points de contrôle du cycle cellulaire. Cela rend les fibroblastes normaux d'un système privilégié pour les études de la régulation du cycle cellulaire, la réparation de l'ADN, et l'apoptose. Le protocole décrit ici fo.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Milieu DMEM/F12	Invitrogen	11330-032
Sérum de veau fœtal (SVF), qualifié	Invitrogen	01437-036	Le sérum qualifié a été pré-testé afin d'assurer un bon soutien de la croissance des fibroblastes primaires.
Antibiotique/Antimycotique	Invitrogen	15420-096
Pénicilline/Streptomycine	Invitrogen	15140-122
Liberase TM Research Grade	Roche	05401127001	Enzyme de remplacement.
Note des auteurs : Étant donné que Roche a cessé la production de Liberase Blendzyme 3 (11814184001), ils recommandent d'utiliser à la place Liberase TM Research Grade, milieu contenant de la thermolysine (n° de catalogue 05401119001 - 10 mg, n° de catalogue 05401127001 - 100 mg). Nous avons effectué ce changement avec succès, sans aucun problème.
Milieu EMEM	ATCC	30-203	Le milieu EMEM fourni par ATCC contient déjà des acides aminés non essentiels et du pyruvate de sodium.
Lame chirurgicale jetable stérile #21 à bord tranchant	Multiples fournisseurs
Incubateur à contrôle tri-gaz	Forma ou Heraeus