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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. La préparation de huA33-TCO
REMARQUE : La synthèse de huA33-TCO a déjà été rapportée. Cependant, pour la commodité du lecteur, il est reproduit ici avec des ajustements pour des conditions optimales.
- Dans un tube de microcentrifugation de 1,7 mL, préparer une solution de 125 μL de carbonate de (E)-cyclooct-4-ényl 2,5-dioxo-1-pyrrolidinyle (TCO-NHS) dans du diméthylformamide sec (DMF) à une concentration de 40 mg/mL (0,15 M). Cette solution peut être aliquote et congelée à -80 °C pour être utilisée dans de futures expériences.
- Dans un tube de microcentrifugation séparé de 1,7 mL, préparer une solution de 5 mg/mL de huA33 dans 1 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS ; 2,7 mM de chlorure de potassium, 137 mM de chlorure de sodium et 11,9 mM de phosphate de potassium, pH 7,4).
- À l’aide de petites aliquotes (<5 μL) de 0,1 M Na2CO3, ajuster le pH de la solution d’anticorps de l’étape 1.2 à 8,8-9,0. Utilisez du papier pH ou un pH-mètre avec une microélectrode pour surveiller le pH et veillez à ce que le pH ne dépasse pas 9,0.
- À la solution d’anticorps décrite à l’étape 1.3, ajoutez lentement un volume correspondant à 40 équivalents molaires de TCO-NHS par rapport à la quantité d’anticorps. Par exemple, si 5 mg (30 nmol) de huA33 se trouvent dans la solution, ajoutez 9,0 μL (1,20 μmol) de la solution à 40 mg/mL (0,15 M) de TCO-NHS.
note: TCO-NHS est hydrophobe. Lorsque vous l’ajoutez à la solution d’anticorps, ajoutez-le lentement et avec agitation pour éviter les précipitations. Ne pas dépasser 10 % de DMF en volume dans la solution réactionnelle finale.
- Laisser incuber la réaction à 25 °C sur un thermomélangeur pendant 1 h avec une légère agitation (500 tr/min).
- Après 1 h, purifier l’immunoconjugué huA33-TCO à l’aide d’une colonne de dessalage à élimination détériorante jetable préemballée.
- Équilibrez la colonne d’exclusion de taille comme décrit par le fournisseur pour éliminer tous les agents de conservation présents dans la colonne pendant l’entreposage. Une procédure typique consiste à laver la colonne 5 fois avec un volume de PBS qui correspond au volume de la colonne : 5 x 2,5 mL de PBS.
- Ajouter le mélange réactionnel dans la colonne d’exclusion de taille en notant le volume du mélange réactionnel.
- Une fois que le mélange réactionnel est entré dans la colonne, ajoutez une quantité appropriée de PBS pour porter le volume total de solution ajouté à la colonne jusqu’à 2,5 mL. Par exemple, si la réaction de conjugaison a donné un volume total de 1,3 ml, ajoutez 1,2 ml de PBS supplémentaire à la colonne.
- Prélever le produit à l’aide de 2 mL de PBS comme éluant.
note: Cette étape produira la construction finale huA33-TCO dans 2 mL de PBS, pH 7,4.
- Mesurez la concentration du huA33-TCO à l’aide d’un spectrophotomètre UV-Vis surveillant la longueur d’onde de 280 nm. Le coefficient d’extinction molaire pour la plupart des IgG (ε280) est de 210 000 M-1 cm-1.
- Si une solution avec une concentration plus élevée d’immunoconjugué est souhaitée, concentrer la solution huA33-TCO à l’aide d’une unité de filtration centrifuge avec une coupure de 50 000 poids moléculaire en suivant les instructions du fabricant.
note: On sait que de nombreux anticorps s’agrègent ou précipitent pendant la concentration. Lorsqu’ils tentent cette procédure avec un nouvel anticorps, les chercheurs doivent s’en remettre à la littérature ou à leur propre expérience de manipulation de l’anticorps en question.
- Conservez l’immunoconjugué huA33-TCO terminé à 4 °C dans l’obscurité si vous en avez besoin immédiatement. S’il doit être utilisé plus de 4 jours à l’avenir, rangez-le à -80 °C dans l’obscurité.
note: Il s’agit d’un point d’arrêt acceptable dans la procédure. L’immunoconjugué huA33-TCO complet doit être stable pendant au moins 6 mois et être stocké à -80 °C dans l’obscurité.
2. La synthèse du Tz-PEG 7-NHBoc
- Dans un tube de microcentrifugation de 1,7 mL, dissoudre 5 mg d’ester N-hydroxysuccinimidylique de tétrazine (Tz-NHS ; 12,6 μmol) dans 0,15 mL de diméthylsulfoxyde anhydre (DMSO).
- Dans un tube de microcentrifugation séparé de 1,7 mL, dissoudre 8 mg du polymère aminé-PEG PROTÉGÉ PAR LE BOC, L'O-(2-Aminoéthyl)O'-[2-(Boc-amino)éthyl]hexaéthylène glycol (NHBoc-PEG7-NH2 ; 17,1 μmol) dans 0,15 mL de DMSO anhydre.
- À la solution de Tz-NHS, ajoutez 3 μL (21,3 μmol, 1,7 équivalents molaires) de triéthylamine (TEA) et mélangez soigneusement.
- Ajouter la solution de tétrazine rose à la solution de NHBoc-PEG7-NH 2 de l’étape 2.2 et incuber le mélange réactionnel pendant 30 minutes à température ambiante (RT) avec une légère agitation.
- Après 30 minutes, diluez le mélange réactionnel 1:1 dansH2O et purifiez-le à l’aide d’une chromatographie liquide à haute performance (HPLC) en phase inverse C18 pour séparer tout Tz-NHS n’ayant pas réagi du Tz-PEG 7-NHBoc. Utilisez des solvants sans acide pour éviter l’élimination prématurée du groupe protecteur Boc. Surveillez à la fois le Tz-PEG 7-NHBoc et le Tz-NHS à une longueur d’onde de 525 nm.
note: Les temps de rétention dépendent fortement de l’équipement HPLC de chaque laboratoire (pompes, colonnes, tubes, etc.), et des contrôles appropriés doivent être effectués avant la purification. Cependant, à titre d’exemple, si l’on utilise un gradient de 5:95 MeCN/H2O (tous deux sans aucun additif) à 95:5 MeCN/H2O sur 30 min, un débit de 1 mL/min et une colonne analytique C18 de 4,6 mm x 250 mm, les temps de rétention du Tz-NHS et du Tz-PEG 7-NHBoc sont de l’ordre de 16 min et 18 min, respectivement.
- Congelez l’éluant HPLC collecté à l’aide d’azote liquide et enveloppez le tube de collecte maintenant congelé dans du papier d’aluminium. Placez le tube de prélèvement congelé sur un lyophiliseur pendant la nuit pour éliminer la phase mobile HPLC. Le produit sera un solide rose vif caractéristique.
note: Si l’azote liquide n’est pas disponible, congelez l’éluant HPLC collecté dans de la glace sèche ou toute la nuit dans un congélateur à -80 °C.
3. La synthèse de Tz-PEG7-NH 2
- Ajouter 1,5 mL de dichlorométhane (DCM) et transférer cette solution dans une petite fiole à fond rond.
- Ajouter 0,25 mL d’acide trifluoroacétique (AFT) goutte à goutte à la solution rose de l’étape 3.1.
- Laisser la réaction incuber pendant 30 minutes à RT avec une légère agitation.
- Après 30 min, évaporez le solvant par évaporation rotative. Ne dépassez pas la température du bain-marie de 37 °C.
- Reconstituer le produit visqueux rose dans 0,5 mL d’eau.
- Purifier le produit à l’aide d’une HPLC C18 en phase inverse pour séparer le Tz-PEG7-NH 2 du précurseur protégé par Boc. Surveillez à la fois le Tz-PEG 7-NHBoc et le Tz-PEG 7-NH 2 à une longueur d’onde de 525 nm.
note: Les temps de rétention dépendent fortement de l’équipement HPLC de chaque laboratoire (pompes, colonnes, tubes, etc.), et des contrôles appropriés doivent être effectués avant la purification. Cependant, à titre d’exemple, si l’on utilise un gradient de 5:95 MeCN/H2O (tous deux avec 0,1 % d’AFT) à 95:5 MeCN/H2O sur 30 min, un débit de 1 mL/min et une colonne analytique C18 de 4,6 mm x 250 mm, les temps de rétention du Tz-PEG 7-NHBoc et du Tz-PEG7-NH 2 sont d’environ 18 min et 13 min, respectivement.
- Congelez l’éluant HPLC collecté à l’aide d’azote liquide et enveloppez le tube de collecte maintenant congelé dans une feuille d’aluminium. Placez le tube de prélèvement congelé sur un lyophiliseur pendant la nuit pour éliminer la phase mobile HPLC. Le produit sera d’un solide rose vif.
- Reconstituer le produit à partir de l’étape 3.7, Tz-PEG7-NH 2, avec 150 μL de DMSO et transférer dans un tube de microcentrifugation de 1,7 mL.
- Mesurez la concentration de Tz-PEG7-NH 2 à l’aide d’un spectrophotomètre UV-Vis surveillant la longueur d’onde de 525 nm. Le coefficient d’extinction molaire de Tz-PEG7-NH 2 (ε525) est de 535 M-1 cm-1.
4. La synthèse de Tz-PEG7-DOTA
- Dissoudre le Tz-PEG7-NH 2 (4,5 mg, 6,9 μmol) dans 0,15 mL de DMSO (ou procéder avec la solution créée à l’étape 3.8).
- Ajouter 22 équivalents molaires de TEA (21 μL, 0,15 mmol) à la solution contenant de la tétrazine à partir de l’étape 4.1.
- Ajouter 10 mg (14,2 μmol) de p-SCN-Bn-DOTA sous forme solide et agiter la solution pendant environ 2 minutes ou jusqu’à ce que la matière soit complètement dissoute.
- Laisser la réaction incuber pendant 30 minutes à RT avec une légère agitation.
- Après 30 min, diluer la réaction 1:1 dansH2O et purifier le produit à l’aide d’une HPLC C18 en phase inverse pour éliminer les p-SCN-Bn-DOTA n’ayant pas réagi. Le p-SCN-Bn-DOTA peut être surveillé à une longueur d’onde de 254 nm, tandis que le Tz-PEG7-DOTA est mieux surveillé à une longueur d’onde de 525 nm.
note: Les temps de rétention sont évidemment très dépendants de l’équipement HPLC de chaque laboratoire (pompes, colonnes, tuyaux, etc.), et des contrôles appropriés doivent être effectués avant la purification. Cependant, à titre d’exemple, si l’on utilise un gradient de 5:95 MeCN/H2O (tous deux avec 0,1 % d’AFT) à 95:5 MeCN/H2O sur 30 min et une colonne analytique C18 de 4,6 x 250 mm, Tz-PEG7-DOTA et p-SCN-Bn-DOTA ont des temps de rétention d’environ 15,6 min et 16,1 min, respectivement.
- Congelez l’éluant HPLC collecté à l’aide d’azote liquide et enveloppez le tube de collecte maintenant congelé dans du papier d’aluminium. Placez le tube de prélèvement congelé sur un lyophiliseur pendant la nuit pour éliminer la phase mobile HPLC. Le produit sera une poudre rose vif.
- Reconstituez le produit dans 0,15 mL de DMSO et mesurez la concentration à l’aide d’un spectrophotomètre UV-Vis surveillant la longueur d’onde de 525 nm. Le coefficient d’extinction molaire pour Tz-PEG7-DOTA (ε525) est de 535 M-1 cm-1.
- Analyser le composé final par résonance magnétique nucléaire (RMN) et spectrométrie de masse à haute résolution (HRMS) pour vérifier que la synthèse a réussi. Voir le tableau 1 pour les changements chimiques et les poids moléculaires déterminés expérimentalement de tous les composés discutés dans ce travail.
- Conservez la solution purifiée de Tz-PEG7-DOTA dans l’obscurité à -80 °C.
note: Il s’agit d’un point d’arrêt acceptable dans la procédure. Le précurseur Tz-PEG7-DOTA terminé est stable pendant au moins 1 an dans ces conditions.
5. 177Lu Radiomarquage de Tz-PEG 7-DOTA
ATTENTION : Cette étape du protocole implique la manipulation et la manipulation de la radioactivité. Avant d'effectuer ces étapes, ou d'effectuer tout autre travail sur la radioactivité, les chercheurs doivent consulter le service de radioprotection de leur établissement d'attache. Prenez toutes les mesures possibles pour minimiser l’exposition aux rayonnements ionisants.
REMARQUE : Lorsque vous travaillez avec de petites quantités de métaux radio, il est recommandé que tous les tampons soient exempts de métaux traces afin d’éviter toute interférence dans la liaison du site de coordination.
- Dans un tube à centrifuger de 1,7 mL, ajouter 200 μL de tampon d’acétate d’ammonium 0,25 M ajusté avec des aliquotes de 1 M HCl à pH 5,5.
note: Si l’on utilise moins de 370 MBq d’activité pour l’étiquetage, le volume de tampon utilisé doit être réduit à 100 μL.
- Ajoutez la quantité souhaitée de [177Lu]LuCl3 à la solution tampon. La quantité ajoutée dépendra du nombre de sujets dans l’expérience et des doses radioactives administrées. Il est recommandé d’ajouter 1 à 2 doses supplémentaires de radioactivité par mesure de précaution pour compenser la perte potentielle de radioactivité pendant les étapes de purification.
- Ajoutez du Tz-PEG7-DOTA dans du DMSO au mélange radioactif à l’étape 5.2. La quantité de Tz-PEG7-DOTA dépend du nombre de sujets testés. Vous trouverez plus de détails à ce sujet à l’étape 6.2.2.2.
- Laisser incuber la solution à 37 °C pendant 20 min.
- Vérifiez que le radiomarquage est complet à l’aide de la chromatographie sur couche mince instantanée (radio-iTLC) avec 50 mM d’EDTA, pH 5,5 comme phase mobile. Le [177Lu]Lu-DOTA-PEG7-Tz marqué restera à la ligne de base — Rf = 0 — tandis que le [177Lu]Lu3+ libre sera coordonné par l’EDTA et se déplacera avec le front du solvant, Rf = 1,0 (figure 1B).
- Si le marquage quantitatif n’est pas réalisé, ajoutez des ligands pour coordonner le radiométal libre. Vous pouvez également purifier le [177Lu]Lu-DOTA-PEG7-Tz marqué à l’aide d’une cartouche C18. Suivez les instructions d’utilisation du fabricant. Un exemple de procédure est donné ci-dessous.
- Amorcez la cartouche en faisant passer lentement 5 ml d’éthanol dans la cartouche à l’aide d’une grosse seringue. Ensuite, passez dans 5 mL d’acétonitrile puis 5 mL de désionisé (DI) H2O.
- Prélevez la solution de radioligand de l’étape 5.3 dans une seringue plus petite et injectez-la lentement dans la cartouche de C18. Ensuite, laver la cartouche avec 10 mL de DI H2O pour enlever tout [177Lu]LuCl3 non lié.
- Eluté avec 500 μL d’éthanol. Retirez tout éthanol du produit final en passant sur le récipient à faible débit d’azote sec ou d’argon pendant 10 à 15 minutes. Par la suite, remettre en suspension le radioligand dans une solution saline dans un volume déterminé à l’étape 6.2.2.2.
6. Études in vivo
ATTENTION : Comme dans la section 5, cette étape du protocole implique la manipulation et la manipulation de la radioactivité. Avant d'effectuer ces étapes, les chercheurs doivent consulter le service de radioprotection de leur établissement d'attache. Prenez toutes les mesures possibles pour minimiser l’exposition aux rayonnements ionisants.
- Préparation des animaux
- Chez les souris nues athymiques femelles, implanter par voie sous-cutanée 5 x 106 cellules cancéreuses colorectales SW1222 en suspension dans 150 μL d’un mélange 1:1 de milieu cellulaire et de matrice cellulaire (p. ex., Matrigel) et laisser ces cellules se développer en une xénogreffe de100 à 150 mm (14 à 18 jours après l’inoculation).
- Tri des animaux pour une expérience de biodistribution
- Une fois que les tumeurs sont de taille suffisante, comme déterminé par la mesure de l’étrier, triez les animaux pour vous assurer que chaque cohorte a à peu près le même volume tumoral moyen. Les animaux se distinguent dans chaque cage par des marques à l’encre indélébile sur la queue (une bague, deux bandes, etc.).
- Tri des animaux pour une étude thérapeutique longitudinale
- Une fois que les tumeurs sont de taille suffisante, comme déterminé par la mesure de l’étrier, attachez des étiquettes d’oreille à chacun des animaux pour assurer un suivi correct tout au long de l’expérience.
note: Les étiquettes d’oreille numériques peuvent tomber tout au long de l’expérience. Par conséquent, il est recommandé d’accompagner ces étiquettes physiques d’encoches d’oreille de manière systématique (c’est-à-dire droite, gauche, bilatérale, droite x 2, gauche x 2).
- Triez les animaux de manière à ce que le volume tumoral moyen dans chaque cohorte soit à peu près égal. La méthode suivante pour le tri des animaux peut être effectuée à l’aide d’un tableur.
- Énumérez les numéros d’identification de l’animal, le motif de l’encoche de l’oreille et le volume de la tumeur dans trois colonnes distinctes.
- Triez les données du plus petit au plus grand volume tumoral.
- Dans une quatrième colonne, attribuez à chaque animal un numéro de cage et parcourez les cages selon un motif de serpent. Par exemple, s’il y a 5 cages, cette colonne sera remplie « 5, 4, 3, 2, 1, 1, 2, 3, 4, 5... » jusqu’à ce que tous les animaux se voient attribuer une cage.
- Une fois les cages attribuées, triez les données par numéro de cage. Si des encoches d’oreille sont utilisées, assurez-vous que chaque animal d’une cage donnée a un motif d’encoche d’oreille unique. S’il y a des doublons (deux ou plus du même motif) dans une cage donnée, échangez une souris avec une souris d’une autre cage avec le motif manquant jusqu’à ce que chaque cage ait des animaux avec des motifs d’encoche d’oreille uniques.
- Formulations et injections
note: La séquence d’injection pour l’étude de biodistribution et de thérapie se déroule comme suit : huA33-TCO est injecté en premier, suivi de [177Lu]Lu-DOTA-PEG7-Tz après un intervalle prédéterminé.
- Immunoconjugué
- Diluer une partie aliquote de la solution huA33-TCO de l’étape 1.9 à une concentration de 0,8 mg/mL dans une solution saline stérile à 0,9 %.
- Prélever des doses de 150 μL (100 μg) de solution de huA33-TCO dans des seringues prétraitées avec de l’albumine sérique bovine (BSA) à 1 % dans du PBS et stocker ces seringues sur ice.
note: Le traitement BSA réduit la liaison non spécifique de l’anticorps aux parois de la seringue.
- Réchauffez l’animal sous une lampe chauffante pendant 3 minutes pour dilater la veine de la queue.
- Injectez la solution huA33-TCO dans la veine de la queue de la souris porteuse de xénogreffe. Attendez 24 h (ou un intervalle de temps prédéterminé différent) pour que le huA33-TCO s’accumule dans la tumeur de la souris.
- Radioligand
- Radiolabel Tz-PEG7-DOTA comme indiqué à la section 5.
- Prélever des doses dans 150 μL de solution saline stérile à 0,9 % contenant 1,1 équivalent molaire de Tz-PEG7-DOTA par rapport à la quantité de huA33-TCO administrée. À titre d’exemple, si 100 μg (0,67 nmol) de huA33-TCO ont été injectés dans l’animal et que le mélange réactionnel [177Lu]Lu-DOTA-PEG7-Tz a été fabriqué avec une activité spécifique de 12,4 GBq/μmol, alors des doses contenant 9,14 MBq d’activité chacune seront prélevées. Cela correspond à 0,74 nmol de Tz (1,1 équivalent molaire par rapport à huA33-TCO).
- Réchauffez les animaux sous une lampe chauffante pendant 3 min pour dilater la veine de la queue.
- Injectez la dose de radioligand dans la veine de la queue de la souris porteuse de la xénogreffe. La quantité d’activité à injecter est déterminée par le chercheur. Les données publiées ont montré des effets thérapeutiques dose-dépendants sur la taille de la tumeur dans une plage de 7,4 à 55,5 MBq.