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REMARQUE : Effectuez toutes les étapes suivantes sous une hotte stérilisée conformément aux bonnes pratiques de laboratoire (BPL).
1. Collecte et stockage du plasma
- Prélever 3 mL d’échantillon de sang périphérique dans un tube K3E EDTA.
- Centrifuger le tube à température ambiante à 1 880 x g pendant 15 min.
- Récupérer le plasma surnageant en aliquotes de 450 μL.
- Conservez les échantillons à -80 °C jusqu’à utilisation.
REMARQUE : Traitez le tube de sang périphérique dans les 2 heures suivant le prélèvement. Lors de la récupération du plasma du tube, ne dérangez pas la couche lymphocytaire.
2. Extraction des miARN circulants à partir d’échantillons de plasma
- Préparez toutes les solutions requises et décongelez les échantillons pour les étapes d’extraction.
- Ajouter 375 μL de 2-mercaptoéthanol à la solution de dénaturation 2x et bien mélanger.
- Ajoutez 21 ml d’éthanol à 100 % de qualité ACS à la solution de lavage de miARN I et mélangez bien.
- Ajouter 40 ml d’éthanol à 100 % de qualité ACS à la solution de lavage 2/3 et bien mélanger.
- Laisser décongeler une aliquote plasmatique à température ambiante, puis commencer les étapes d’extraction.
- Extraction organique
- Transvaser 400 μL de l’échantillon de plasma dans un tube de 2 mL sans RNase.
- Ajouter 400 μL de solution dénaturante 2x, mélanger par vortex et centrifuger brièvement.
- Ajouter 4 μL de 1 nM de spike-in, mélanger par vortex et centrifuger brièvement.
- Ajouter 800 μL de phénol-chloroforme acide.
- Vortex pendant 60 s et centrifugeuse à vitesse maximale (≥10 000 x g) pendant 15 minutes.
- Transférez la phase aqueuse supérieure dans un tube frais. Ne dérangez pas l’interphase. Notez le volume récupéré et jetez le tube contenant la phase non aqueuse.
note: La solution dénaturante 2x est stockée à 4 °C et peut se solidifier à cette température. Avant utilisation, réchauffez la solution à 37 °C, en agitant de temps en temps pendant 10 à 15 minutes. Veillez à ne pas retirer la phase inférieure contenant l’acide phénol-chloroforme, et non le tampon aqueux qui se trouve au-dessus du mélange. Préchauffer la solution d’élution ou l’eau exempte de nucléases à 95 °C. Veiller à chauffer un volume adéquat de solution (100 μL par échantillon + 10 % d’excès).
- Enrichissement en ARN de petite taille
- Ajouter 1/3 de volume d’éthanol à 100 % à la phase aqueuse à partir de l’étape 2.2.6 et bien mélanger.
- Placez une cartouche filtrante dans un tube de prélèvement frais pour chaque échantillon.
- Transférez jusqu’à 700 μL de lysat à partir de l’étape 2.3.1 et d’éthanol dans la cartouche filtrante et centrifugez à 10 000 x g pendant 30 s.
- S’il reste > 700 μL de mélange, placez le filtrat dans un tube frais et répétez l’étape 2.3.3 jusqu’à ce que tout le mélange ait traversé la cartouche filtrante.
- Mesurez le volume total de l’écoulement continu.
- Ajouter 2/3 volume d’éthanol à 100 % au filtrat et bien mélanger.
- Placez une deuxième cartouche filtrante dans un tube de collecte frais.
- Transférez jusqu’à 700 μL de volume d’échantillon dans la cartouche et centrifugez à 10 000 x g pendant 30 s. Jetez le flux.
- Répétez l’étape 1.3.8 jusqu’à ce que tout le mélange soit passé à travers la cartouche filtrante.
- Appliquer 700 μL de solution de lavage de miARN 1 dans la cartouche filtrante et centrifuger la cartouche filtrante avec le tube collecteur à 10 000 x g pendant 15 s. Jeter le flux. Placez la cartouche filtrante dans le même tube de collecte.
- Appliquer 500 μL de solution de lavage 2/3 sur la cartouche filtrante et centrifuger la cartouche filtrante avec le tube de prélèvement à 10 000 x g pendant 15 s. Jeter le passage continu. Placez la cartouche filtrante dans un tube de collecte frais.
- Placez la cartouche filtrante dans un tube de récupération frais et répétez l’étape 2.3.11 avec 500 μL de solution de lavage 2/3. Jetez le flux continu et transférez la cartouche filtrante dans un tube de collecte frais.
- Centrifuger les tubes avec les cartouches filtrantes à 10 000 x g pendant 1 min.
- Transférez la cartouche filtrante dans un tube de prélèvement frais de 1,5 mL et ajoutez 100 μL de solution d’élution préchauffée (95 °C) ou d’eau sans nucléases.
- Centrifugeuse à 10 000 x g pendant 30 s pour récupérer les miARN et les stocker à -80 °C.
note: Un précipité blanc peut se former dans la solution de lavage 2/3. Ce précipité est l’excès d’EDTA libéré de la solution. Évitez d’aspirer ces cristaux pendant les étapes de pipetage.