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Toutes les procédures impliquant des animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Isolement de l’ADN génomique à partir de selles
REMARQUE : Utiliser un kit commercial pour isoler l’ADN microbien des selles en suivant un protocole de détection des agents pathogènes dans les selles. Sortez les échantillons directement du congélateur à -80 °C et rangez-les sur de la glace carbonique pendant la pesée.
- Transférez jusqu’à 220 mg de selles dans un tube microfuge propre contenant 1,4 mL de tampon de lyse des selles à température ambiante (voir le tableau des matières).
- Prélever un échantillon vortex pendant 1 min pour bien homogénéiser les solides (figure 1B). Chauffer la suspension à 95 °C pendant 5 min pour lyser toutes les bactéries (y compris les bactéries à Gram positif).
- Vortex échantillonne pendant 15 s, puis centrifuge à 20 000 x g pendant 1 min pour granuler les solides des selles. Transférer le surnageant dans un tube de microfuge de 2 mL. Ajouter un comprimé à chaque échantillon pour absorber les inhibiteurs de la PCR, agiter jusqu’à ce que le comprimé soit dissous et incuber l’échantillon à RT pendant 1 min.
- Centrifuger l’échantillon à 20 000 x g pendant 3 min et transférer le surnageant dans un nouveau tube de microfuge. Centrifugeuse à 20 000 x g pendant 3 min. Aliquote 15 μL de protéinase K (20 mg/mL de stock) dans un nouveau tube de microfuge de 1,5 mL. Pipeter 200 μL de l’échantillon dans le tube contenant la protéinase K.
- Ajouter 200 μL de tampon de lyse au chlorure de guanidinium dans le tube, agiter à fond pendant 15 s (voir le tableau des matériaux) et incuber l’échantillon à 70 °C pendant 10 min. Ajouter 200 μL d’éthanol (96-100 %) dans les tubes et bien mélanger par vortex.
- Placez une colonne de centrifugation à base de silice dans un tube de prélèvement de 2 mL et appliquez les échantillons sur la colonne. Fermez le couvercle et centrifugez pendant 1 min à 20 000 x g.
- Transférez la colonne dans un nouveau tube de collecte de 2 mL et ajoutez 500 μL de tampon de lavage 1 dans la colonne, bouchez la colonne et centrifugez pendant 1 min à 20 000 x g. Transférez la colonne dans un nouveau tube de collecte de 2 mL et ajoutez 500 μL de tampon de lavage 2 dans la colonne, Fermez le capuchon et centrifugez à 20 000 x g pendant 3 min.
- Avec le capuchon fermé, transférez la colonne dans un nouveau tube de collecte de 2 mL et centrifugez pendant 1 min supplémentaire à 20 000 x g pour éliminer le tampon de lavage résiduel. Transférez la colonne dans un tube microfuge marqué de 1,5 mL et éluez l’échantillon en ajoutant 200 μL de tampon d’élution contenant de l’EDTA à la membrane (voir le tableau des matériaux).
- Fermez le capuchon et incubez à RT pendant 1 min. Centrifugez l’échantillon pendant 1 min à 20 000 x g. Jetez la colonne.
2. Détermination de la concentration d’ADN et préparation de l’échantillon pour la PCR
REMARQUE : Utilisez un fluorimètre et un test fluorescent d’ADNdb disponible dans le commerce pour déterminer la concentration d’ADN génomique dans chaque échantillon (voir le tableau des matériaux). Le colorant fluorescent doit se lier spécifiquement à l’ADN double brin.
- Préparez une dilution de 1:200 de chaque échantillon (1 μL de chaque échantillon dans un mélange maître d’ADNdb de 199 μL) et une dilution de 1:50 des étalons. Analysez sur un fluorimètre à l’aide du dsDNA setting.
Remarque : Un volume élevé d’ADN dans la PCR peut être inhibiteur, par conséquent, le volume d’ADN utilisé ne doit pas dépasser 10 % du volume final de la PCR. Un fluorimètre permet une mesure précise de l’ADN dans l’échantillon, car seul l’ADN lié au colorant fluorescent sera fluorescent, éliminant ainsi la contribution possible des contaminants à la concentration finale d’ADN calculée. Ce niveau de quantification précise est essentiel pour l’application de séquençage en aval.
- Préparez des matrices de PCR diluées à 5 ng/μL avec le volume approprié de 10 mM de Tris, pH 8,5 pour constituer des stocks de matrices de travail de chaque échantillon.
- Conservez les échantillons à -20 °C.
3. Concevoir des amorces pour les régions en V souhaitées 16S
- Concevez des amorces pour amplifier sélectivement les régions souhaitées de l’ARNr V 16S.
- Analysez les amorces avec Probe Match, du projet de base de données ribosomiales, pour déterminer le taux de réussite approximatif pour divers embranchements.
Remarque : Pour les régions V1-V3, la présente étude a utilisé les amorces publiées Bosshard forward, qui se lient à la position 8 dans la région V1, et 533 reverse, qui se lient à la position 533 dans la région V3. Les amorces doivent inclure des séquences d’adaptateur de porte-à-faux pour l’indexation.
- Lors de la conception des amorces, inclure des séquences d'adaptateur aux extrémités 5' de chaque amorce, comme recommandé pour la préparation de la banque de séquençage métagénomique 16S (Tableau 1).
- Synthétisez ces grandes amorces avec la purification par cartouche. Reconstituer des amorces desséchées et diluer une substance de travail PCR à 1 μM dans 10 mM de Tris, pH 8,5.
4. PCR Amplicon pour amplifier la ou les régions V avec des séquences d’adaptateur en porte-à-faux attachées
- Configurez le mélange de réactions de PCR d’amplicon comme décrit dans le Tableau 2.
- Placez un sceau adhésif transparent sur la plaque et exécutez l’amplicon PCR en utilisant les paramètres du tableau 3.
- (Facultatif) Exécutez des produits de PCR d’amplicon sur un gel d’agarose ou un test d’ADN à haute sensibilité qui permet une mesure quantitative de la taille de l’amplicon (voir le tableau des matériaux).
Remarque : La taille de l’amplicon de cette étude est de 550 pb (figure 2a).
5. Nettoyage par PCR à l’aide de billes magnétiques
- Centrifugez rapidement la plaque de PCR d’amplicon à 1 000 x g pendant 1 min pour collecter la condensation.
note: Des bandelettes de tube PCR peuvent être utilisées à la place des plaques PCR pour minimiser la contamination. Jetez les couvercles de tube et ne les réutilisez jamais.
- Vortex les billes magnétiques pour les disperser uniformément et ajoutez 20 μL de billes magnétiques dans chaque puits de PCR d’amplicon, puis pipetez tout le volume de haut en bas lentement 10 fois.
- Incuber à RT pendant 5 min. Placez la plaque de PCR sur un support magnétique pendant 2 min jusqu’à ce que les billes magnétiques soient collectées et que le surnageant soit clair. Retirez et jetez le surnageant.
- Lavez les billes avec 200 μL d’éthanol frais à 80 % pendant que la plaque PCR est sur le support magnétique et incubez pendant 30 s à RT sur le support magnétique. Retirez délicatement le surnageant.
- Répétez le lavage une deuxième fois. Maintenant, utilisez une pointe de pipette fine pour éliminer tout résidu d’éthanol des puits et laissez sécher à l’air libre pendant 10 min.
- Retirez la plaque PCR du support magnétique et ajoutez 52,5 μL de 10 mM de Tris pH 8,5 dans chaque puits. Pipette de haut en bas 10 fois pour suspendre les billes et incuber à température ambiante pendant 2 min.
- Transférez la plaque PCR sur le support magnétique pour recueillir les billes magnétiques et transférez 50 μL du surnageant sur une plaque PCR propre. Placez un joint adhésif transparent pour plaque PCR sur la plaque et conservez-le à -20 °C jusqu’à une semaine.
| Amplicon Amorces PCR |
| en avant | 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGagagtttgatcMtggctcag-3' |
| inverse | 5'- GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGTTACCGCGGCTGCTGGCAC -3' |
| Les séquences spécifiques aux locus sont indiquées en gras et la séquence non grasse est la séquence de l’adaptateur de porte-à-faux. |
Tableau 1 : Amorces PCR Amplicon.
| Configuration de la réaction PCR d’Amplicon | |
| volume |
| ADN microbien (5ng/μl) | 2,5 μl |
| Amorce directe (1 μM ; à partir de l’étape 3.1) | 5,0 μl |
| Amorce inversée (1 μM ; à partir de l’étape 3.1) | 5,0 μl |
| 2X HotStart Ready Mix | 12,5 μl |
| total | 25,0 μl |
Tableau 2 : Amorces PCR Amplicon.
| Configuration de la PCR Amplicon |
| 95 °C pendant 3 minutes | |
| 25 cycles de : | |
| 95 °C pendant 30 secondes |
| 55 °C pendant 30 secondes |
| 72 °C pendant 60 secondes |
| 72 °C pendant 3 minutes | |
| Maintien à 4 °C | |
Tableau 3 : Mise en place du programme Amplicon PCR.
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