Marquage des cellules organoïdes du CRC : une méthode pour générer des cellules organoïdes de cancer colorectal transduites par le lentivirus GFP

Résumé

Source : Okazawa Y. et al., Détection à haute sensibilité des micrométastases générées par des organoïdes transduits par le lentivirus GFP cultivés à partir d’une tumeur du côlon dérivée d’un patient. J. Vis. Exp. (2018).

Cette vidéo décrit la technique de génération d’organoïdes CRC transduits par des particules lentivirales GFP pour permettre l’imagerie fluorescente. Ces organoïdes marqués à la GFP, lorsqu’ils sont placés dans des modèles animaux, aident à étudier l’invasion tumorale et les métastases.

Protocole

1. Génération des organoïdes CRC cultivés sur une matrice extracellulaire artificielle

Les procédures expérimentales pour la culture d’organoïdes CRC des PDX du côlon sont décrites à la figure 1B (étape 4).

1. Établir un milieu de culture adapté aux organoïdes du CCR dérivés de la PDX (voir le tableau des matières, « le milieu de culture d’organoïdes du CRC ») en utilisant les milieux précédemment décrits pour les organoïdes du côlon humain.
2. Appliquez 150 μL de matrice extracellulaire artificielle (voir Tableau des matériaux) par puits sur une plaque de 12 puits sur de la glace, puis incubez-la pendant 30 à 60 minutes dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO₂ pour solidifier les gels.
3. Suspendre la pastille cellulaire des cellules CRC obtenues à partir du modèle murin PDX avec le milieu de culture organoïde CRC (à partir de l’étape 1.1) avec 5 % de FCS pour ajuster à 3 x 10⁵ cellules/mL. Ensuite, ensemencez 1 mL du milieu sur la plaque artificielle recouverte d’une matrice extracellulaire préparée à l’étape 1.2 et incubez pendant une nuit à 37 °C sous 5 % de CO₂. Utilisez un hémocytomètre pour compter le nombre de cellules tumorales, y compris les cellules uniques et les amas multicellulaires (un groupe de cellules adhérentes) dans la suspension cellulaire.
   REMARQUE : 5 % de FCS est utilisé pour éteindre l’activité enzymatique résiduelle de la collagénase dans cette étude.
4. Le lendemain, on recueille soigneusement le milieu de culture, y compris les cellules flottantes détachées de la plaque artificielle recouverte d’une matrice extracellulaire, dans un tube à centrifuger de 1,5 mL et on le centrifuge à 1 400 x g pendant 5 min. Ensuite, retirez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans 70 μL de matrice extracellulaire artificielle sur de la glace.
5. Pour augmenter la viabilité des cellules CRC, superposez la matrice extracellulaire artificielle contenant des cellules tumorales sur les cellules organoïdes tumorales attachées à la plaque recouverte d’une matrice extracellulaire artificielle et incubez pendant 30 minutes dans un incubateur à 37 °C, 5 % de CO₂ pour solidifier le revêtement de matrice extracellulaire artificielle. Ensuite, incubez-le avec 1 mL de milieu de culture de cellules organoïdes CRC avec 1 % de FCS à 37 °C sous 5 % de CO₂.
6. Changez de milieu de culture tous les deux jours. Au fur et à mesure que les organoïdes CRC remplissent le milieu, il peut devenir nécessaire de changer le milieu tous les jours.

2. Génération et enrichissement de particules lentivirales GFP

Les procédures expérimentales pour la génération et l’enrichissement des particules lentivirales GFP sont décrites à la figure 1C (étape 5).

1. Cultivez HEK293T cellules avec un milieu 1640 du Roswell Park Memorial Institute (RPMI) contenant 10 % de FCS et préparez six boîtes de 10 cm (2 x 10⁶ cellules par boîte) pour la procédure de transfection suivante.
2. Pour la transfection par boîte, préparer 500 μL du mélange, y compris 20 μL du réactif de transfection dans du DMEM avec un vecteur PRRL-GFP (5 μg) et deux plasmides d’emballage lentiviraux, tels que pCMV-VSV-G (1 μg) et pCMV-dR8.2 dvpr (5 μg), dans un microtube stérile de 1,5 mL. Conservez le mélange à température ambiante pendant 20 min, puis superposez-le sur chacun des plats de 10 cm et incubez-les pendant 18 h.
3. Retirer le moyen, ajouter 5 ml de milieu frais 10 % FCS-RPMI 1640 dans chaque plat et laisser reposer pendant 24 h.
4. Recueillir le milieu conditionné de chaque plat dans un tube à centrifuger de 50 mL et stocker un total de 30 mL du milieu à 4 °C pendant la nuit. Ajouter 5 ml de RPMI 1640 frais dans chaque plat et laisser reposer pendant 24 h.
5. Recueillir le milieu conditionné de chaque plat dans un tube à centrifuger de 50 mL et conserver, au total, 30 mL du milieu sur de la glace. Ensuite, jetez les cellules.
6. Filtrez 60 ml du fluide (à partir des étapes 2.4-2.5) à travers un filtre de 0,45 μm pour retirer les cellules et divisez cette quantité dans douze tubes à centrifuger en polypropylène de 5 ml pour l’ultracentrifugation.
7. Pour concentrer les virus, il faut les centrifuger à l’aide d’un rotor à godets oscillants à 85 327 x g pendant 1,5 h à 4 °C.
8. Retirez immédiatement le fluide. Pour résoudre la pastille virale concentrée, placez 250 μL de milieu nutritif Mélange de jambon F-12 (F12)/DMEM sans SCA dans chacun des douze tubes et maintenez-le à 4 °C pendant la nuit. Notez que la pastille virale est souvent invisible.
9. Pipeter doucement le milieu pour prélever 3 mL du stock concentré de lentivirus 5x GFP, au total, y compris probablement des particules lentivirales GFP avec 10⁸ unités de transduction par mL (TU/mL). Ensuite, conservez les douze microtubes de 1,5 ml (dont 250 μL par tube) dans des conditions stériles à -80 °C pendant un an au maximum. Préparez de nombreuses petites aliquotes de la solution d’origine pour éviter plusieurs cycles de gel-dégel.

3. Marquage des cellules organoïdes du CCR avec des particules lentivirales GFP cultivées sur une matrice extracellulaire artificielle

Les procédures expérimentales de marquage des cellules organoïdes du CRC avec le lentivirus GFP sont décrites à la figure 1C (étape 6).

1. Laissez les organoïdes CRC préparés à l’étape 1.6 croître sans interférence pendant 7 à 10 jours, récoltez-les mécaniquement à l’aide d’un grattoir à cellules stériles et transférez-les dans un microtube de 1,5 mL.
   note: La croissance des organoïdes du CCR en culture dépend de la nature des tumeurs d’origine des patients. Évitez la prolifération des organoïdes du CRC en les maintenant à 60-70 % de confluence avant de les transférer à un rapport de division de 1:2 sur une nouvelle plaque artificielle à 12 puits recouverte d’une matrice extracellulaire.
2. Centrifugez le microtube pendant 3 min à 1 400 x g, retirez le milieu de culture et dissolvez la pastille cellulaire dans 500 μL de PBS par tapotement doux.
3. Centrifugez le microtube pendant 3 min à 1 400 x g et éliminez le PBS.
4. Pour dissocier les organoïdes du CCR adhérents, ajoutez 500 μL d’une solution de détachement cellulaire d’enzymes protéolytiques et collagénolytiques à la pastille cellulaire dans le tube et mélangez-la en tapotant doucement. Ensuite, laissez reposer les tubes pendant 10 min à température ambiante.
5. Pipetez très doucement la suspension cellulaire avec 500 μL supplémentaires de FCS-DMEM à 1 % plusieurs fois dans un microtube de 1,5 mL pour dissocier grossièrement les cellules. La génération de cellules uniques à partir des organoïdes du CRC par pipetage brutal réduit considérablement la viabilité cellulaire. Ainsi, il est essentiel de laisser la masse de cellules visuellement détectable dans la suspension cellulaire en pipetant doucement dans un microtube de 1,5 mL.
6. Centrifuger la suspension cellulaire pendant 3 min à 1 400 x g et retirer le surnageant.
7. Résoudre la pastille cellulaire avec un mélange de 100 μL de stock de lentivirus 5x GFP (>10 8 TU/mL) et de 400 μL de milieu de culture organoïde CRC dans un microtube de 1,5 mL en tapotant doucement pour ajuster à une concentration de 5 x 10⁵ cellules tumorales dissociées par 500 μL. Utiliser un hémocytomètre pour compter le nombre de cellules tumorales, Inclure des cellules simples et des groupes de cellules dans la suspension cellulaire, comme décrit ci-dessus (étape 1.3).
8. Préparez une plaque artificielle à 12 puits recouverte d’une matrice extracellulaire, comme décrit à l’étape 1.2. Ensuite, placez 500 μL de la suspension cellulaire préparée à l’étape 3.7 sur la plaque et laissez-la pendant 18 h à 37 °C sous 5 % de CO₂.
9. Recueillir le milieu avec les cellules flottantes détachées de la plaque artificielle recouverte d’une matrice extracellulaire dans un tube de centrifugation de 1,5 mL. Centrifugez-le à 1 400 x g, puis retirez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans 70 μL de matrice extracellulaire artificielle sur de la glace.
10. Pour augmenter la viabilité des cellules du CCR, superposez la matrice extracellulaire artificielle contenant des cellules tumorales sur les organoïdes tumoraux fixés à la plaque à 12 puits recouverte d’une matrice extracellulaire artificielle, comme décrit à l’étape 1.5. Ensuite, incubez la plaque pendant 30 minutes dans un incubateur à 37 °C, 5 % de CO₂ pour solidifier le revêtement artificiel de la matrice extracellulaire, puis cultivez-la avec 1 mL de milieu de culture organoïde CRC avec 1 % de FCS à 37 °C sous 5 % de CO₂.
11. Observer les cellules trois jours après l’infection au microscope à fluorescence pour confirmer une positivité de la GFP de près de 100 % due à l’utilisation d’un titre élevé de particules lentivirales (voir figure 2A).
12. Cultivez les organoïdes du CCR pendant 7 à 10 jours pour augmenter la croissance cellulaire avant de les injecter chez les souris receveuses.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Plaque à 12 puits	BMBio	Réf. 92412
microtube	Eppendorf	#0030120086	Autoclave avant utilisation
Hémocytomètre	Erma	#03-202-1
Matrice de membrane basale Matrigel	Corning	#354234	Conserver les aliquotes à -20 °C. Placer sur de la glace jusqu’à utilisation
Collagénase de type 1	sigma	#C1030	150 mg/ml de collagénase de type 1 dans le 1×PBS. Conserver les aliquotes à -20 °C jusqu’à 1 an
DMEM/F-12 avec GlutaMAX™	Gibco	#10565018
pénicilline	Gibco	#15140122	A conserver à 4°C. Utilisation dans un délai de 1 mois
hEGF	PEPROTECH	#AF-100-15	Conserver à -20°C. Ajouter à medium le même jour que l’utilisation
Y27632, un inhibiteur de ROCK	Wako	Réf. 253-00591	Conserver à -20°C. Ajouter à medium le même jour que l’utilisation
streptomycine	Gibco	#15140122	A conserver à 4°C. Utilisation dans un délai de 1 mois
Milieu de culture organoïde CRC avec 1 % ou 5 % de FCS			DMEM/F-12 avec supplément GlutaMAX™ (Gibco #10565018) complété par 1 % ou 5 % de FCS, 100 U/ml de pénicilline, 100 μg/ml de streptomycine, 2 ng/ml hEGF et 10 μM Y27632, un inhibiteur de ROCK. Conserver à 4°C. Utiliser dans un délai de 1 mois.
Vecteur PRRL-GFP	Don du Dr Robert A. Weinberg
le régent de transfection FuGENE 6	Roche	11814 443001
pCMV-VSV-G	Don du Dr Robert A. Weinberg
pCMV-dR8.2 dvpr	Don du Dr Robert A. Weinberg
un microscope à stéréofluorescence Zeiss Axioplan 2	Zeiss