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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Dissection des PDX CRC chez la souris
Les procédures expérimentales de dissection des PDX CRC sont décrites à la figure 1B (étape 2).
- Laissez la tumeur se développer sous-cutanéement jusqu’à ~1 cm3 de taille, ce qui prend généralement environ 1 à 3 mois.
- Anesthésie la souris avec l’inhalation d’isoflurane à l’aide de l’appareil d’anesthésie par inhalation pour petits animaux et désinfecte la peau avec de l’éthanol à 70 %.
- Placez la souris en position couchée sur la paillasse du laboratoire. Incisez la peau, exposez la tumeur et détachez soigneusement la peau de la tumeur à l’aide de ciseaux stériles. Après avoir retiré la tumeur, placez-la sur une boîte de Pétri de 10 cm, retirez toutes les régions grossièrement nécrotiques de la tumeur, puis rincez deux fois avec 5 ml de PBS.
note: Les zones nécrotiques sont souvent plus blanches, plus molles et plus friables que les zones environnantes.
- Placez la tumeur sur de la glace et divisez-la également en au moins 4 parties pour différentes applications, y compris 1) la culture d’organoïdes CRC, 2) la transplantation chez des souris secondaires, 3) l’examen histologique et 4) la congélation et le stockage des fragments de tumeur.
- Pour la génération des organoïdes du CCR, placez le tissu tumoral solide sur une boîte de Pétri de 6 cm contenant 1 mL de PBS stérile. Gardez le mouchoir sur de la glace jusqu’au traitement.
- Pour établir le modèle PDX pour le CCR humain, passez les PDX CRC récents dans une souris secondaire. Coupez le tissu tumoral en petits morceaux (5 x 5 x 5 mm3 mm) à l’aide de lames de rasoir stériles et trempez doucement ces fragments de tissu dans 50 μL de matrice extracellulaire artificielle. Ensuite, implantez ces fragments dans les parties inférieures des poches sous-cutanées droite et gauche de la souris NOG.
- Placez la souris anesthésiée en position couchée sur la paillasse du laboratoire. Faites une petite incision sur les parties inférieures des flancs droit et gauche de la souris receveuse pour générer des poches sous-cutanées pour l’implantation tissulaire à l’aide de ciseaux stériles. Veillez à ne pas percer la membrane péritonéale. Il devrait y avoir peu de saignement avec cette procédure.
- Trempez doucement les fragments tumoraux préparés ci-dessus dans 50 μL de matrice extracellulaire artificielle, puis implantez-les dans les parties inférieures des poches sous-cutanées droite et gauche.
- Suturez l’incision avec des clips de plaie chez les souris subissant des interventions chirurgicales. Assurez-vous que les tissus tumoraux implantés sont situés à une certaine distance de l’incision sous la peau.
note: Conformément à la minimisation des interventions chirurgicales, aucun traitement de la douleur et de l’infection post-chirurgicales n’a été administré dans cette étude.
- Placez la souris sur un tapis chaud et maintenez la position couchée sternale jusqu’à ce que la conscience soit rétablie. Une fois complètement récupérées et capables de s’asseoir sur leurs quatre pattes, les souris peuvent être renvoyées dans leurs cages d’origine. Pour éviter la prédation, ne permettez pas la reproduction avec des animaux non opérés dans la même cage.
- Pour l’analyse histologique, fixer les échantillons dans 5 mL de formol tamponné à 10 % neutre dans un tube conique de 15 mL à température ambiante pendant 2 jours.
- Pour la cryoconservation, coupez le tissu tumoral en petits morceaux (5 x 5 x 5 mmde 3 po) et trempez doucement les échantillons dans 500 μL de solution de congélation cellulaire dans des tubes cryogéniques de 1 à 1,5 ml. Ensuite, transférez le tube dans un congélateur à -80 °C.
2. Extraction des PDX dans la suspension cellulaire pour la culture organoïde du CRC
Les procédures expérimentales de dissociation des PDX CRC sont décrites à la figure 1B (étape 3).
- Placez les fragments de tumeur préparés ci-dessus (étape 1.4.1) sur une boîte de Pétri de 10 cm.
- Hachez les fragments à l'aide de lames de rasoir stériles et transférez-les dans un tube conique de 15 ml contenant 8 ml de sérum de veau fœtal à 10 % (SCF) - milieu d'aigle modifié de Dulbecco (DMEM) avec 80 μL de stock d'enzymes collagénases (voir le tableau des matériaux).
- Fermez bien le tube et enveloppez le capuchon avec du parafilm pour éviter les fuites. Pour dissocier les fragments tumoraux hachés dans la suspension cellulaire, agitez-le doucement pendant 2 h à 37 °C. Notez qu’il restera encore de nombreux fragments de tissu non digéré dans le tube.
- Centrifuger le tube à 300 x g pendant 5 min à 4 °C et retirer le surnageant. Résoudre la pastille cellulaire à l’aide de 10 ml de FCS-DMEM à 10 % pour fabriquer la suspension cellulaire.
- Pour éliminer les débris de tissus non digérés, filtrez la suspension cellulaire deux fois à l’aide de la passoire cellulaire de 40 μm placée sur un tube conique de 50 ml. Ensuite, centrifugez le flux à 300 x g pendant 5 min à 4 °C. Retirez le surnageant et maintenez la pastille sur de la glace.
3. Génération des organoïdes CRC cultivés sur une matrice extracellulaire artificielle
Les procédures expérimentales pour la culture d’organoïdes CRC des PDX du côlon sont décrites à la figure 1B (étape 4).
- Établir un milieu de culture adapté aux organoïdes du CCR dérivés de la PDX (voir le tableau des matières, « le milieu de culture d’organoïdes du CRC ») en utilisant les milieux précédemment décrits pour les organoïdes du côlon humain.
- Appliquez 150 μL de matrice extracellulaire artificielle (voir Tableau des matériaux) par puits sur une plaque de 12 puits sur de la glace, puis incubez-la pendant 30 à 60 minutes dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO2 pour solidifier les gels.
- Suspendre la pastille cellulaire de l’étape 2.5 avec le milieu de culture organoïde CRC (à partir de l’étape 3.1) avec 5 % de FCS pour obtenir un ajustement à 3 x 105 cellules/mL. Ensuite, ensemencez 1 mL du milieu dans la plaque artificielle recouverte d’une matrice extracellulaire préparée à l’étape 3.2. et incuber toute la nuit à 37 °C sous 5 % de CO2. Utilisez un hémocytomètre pour compter le nombre de cellules tumorales, y compris les cellules uniques et les amas multicellulaires (un groupe de cellules adhérentes) dans la suspension cellulaire.
REMARQUE : 5 % de FCS est utilisé pour éteindre l’activité enzymatique résiduelle de la collagénase dans cette étude.
- Le lendemain, on recueille soigneusement le milieu de culture, y compris les cellules flottantes détachées de la plaque artificielle recouverte d’une matrice extracellulaire, dans un tube à centrifuger de 1,5 mL et on le centrifuge à 1 400 x g pendant 5 min. Ensuite, retirez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans 70 μl de matrice extracellulaire artificielle sur de la glace.
- Pour augmenter la viabilité des cellules CRC, superposez la matrice extracellulaire artificielle contenant des cellules tumorales sur les cellules organoïdes tumorales attachées à la plaque recouverte d’une matrice extracellulaire artificielle et incubez pendant 30 minutes dans un incubateur à 37 °C, 5 % de CO2 pour solidifier le revêtement de matrice extracellulaire artificielle. Ensuite, incubez-le avec 1 mL de milieu de culture de cellules organoïdes CRC avec 1 % de FCS à 37 °C sous 5 % de CO2.
- Changez de milieu de culture tous les deux jours. Au fur et à mesure que les organoïdes CRC remplissent le milieu, il peut devenir nécessaire de changer le milieu tous les jours.
4. Génération et enrichissement de particules lentivirales GFP
Les procédures expérimentales pour la génération et l’enrichissement des particules lentivirales GFP sont décrites à la figure 1C (étape 5).
- Cultivez HEK293T cellules avec un milieu 1640 du Roswell Park Memorial Institute (RPMI) contenant 10 % de FCS et préparez six boîtes de 10 cm (2 x 106 cellules par boîte) pour la procédure de transfection suivante.
- Pour la transfection par boîte, préparer 500 μL du mélange, y compris 20 μl du réactif de transfection dans du DMEM avec un vecteur PRRL-GFP (5 μg)12 et deux plasmides d’emballage lentiviraux, tels que pCMV-VSV-G (1 μg) et pCMV-dR8.2 dvpr (5 μg), dans un microtube stérile de 1,5 mL. Conservez le mélange à température ambiante pendant 20 min, puis superposez-le sur chacun des plats de 10 cm et incubez-les pendant 18 h.
- Retirer le moyen, ajouter 5 ml de milieu frais 10 % FCS-RPMI 1640 dans chaque plat et laisser reposer pendant 24 h.
- Recueillir le milieu conditionné de chaque plat dans un tube à centrifuger de 50 mL et stocker un total de 30 mL du milieu à 4 °C pendant la nuit. Ajouter 5 ml de RPMI 1640 frais dans chaque plat et laisser reposer pendant 24 h.
- Recueillir le milieu conditionné de chaque plat dans un tube à centrifuger de 50 mL et conserver, au total, 30 mL du milieu sur de la glace. Ensuite, jetez les cellules.
- Filtrer 60 ml du fluide (à partir des étapes 4.4-4.5) à travers un filtre de 0,45 μm pour retirer les cellules et diviser cette quantité en douze tubes à centrifuger en polypropylène de 5 ml pour l’ultracentrifugation.
- Pour concentrer les virus, il faut les centrifuger à l’aide d’un rotor à godets oscillants (voir tableau des matières) à 85 327 x g pendant 1,5 h à 4 °C.
- Retirez immédiatement le fluide. Pour résoudre la pastille virale concentrée, placez 250 μL de milieu nutritif Mélange de jambon F-12 (F12)/DMEM sans SCA dans chacun des douze tubes et maintenez-le à 4 °C pendant la nuit. Notez que la pastille virale est souvent invisible.
- Pipeter doucement le milieu pour prélever 3 mL du stock concentré de lentivirus 5x GFP, au total, y compris probablement des particules lentivirales GFP avec 108 unités de transduction par mL (TU/mL). Ensuite, conservez les douze microtubes de 1,5 ml (dont 250 μL par tube) dans des conditions stériles à -80 °C pendant un an au maximum. Préparez de nombreuses petites aliquotes de la solution d’origine pour éviter plusieurs cycles de gel-dégel.
5. Marquage des cellules organoïdes du CRC avec des particules lentivirales GFP cultivées sur une matrice extracellulaire artificielle
Les procédures expérimentales de marquage des cellules organoïdes du CRC avec le lentivirus GFP sont décrites à la figure 1C (étape 6).
- Laissez les organoïdes CRC préparés à l’étape 3.6 croître sans interférence pendant 7 à 10 jours, récoltez-les mécaniquement à l’aide d’un grattoir à cellules stériles, puis transférez-les dans un microtube de 1,5 mL.
note: La croissance des organoïdes du CCR en culture dépend de la nature des tumeurs d’origine des patients. Évitez la prolifération des organoïdes du CRC en les maintenant à 60-70 % de confluence avant de les transférer à un rapport de division de 1:2 sur une nouvelle plaque artificielle à 12 puits recouverte d’une matrice extracellulaire.
- Centrifugez le microtube pendant 3 min à 1 400 x g, retirez le milieu de culture et dissolvez la pastille cellulaire dans 500 μL de PBS par tapotement doux.
- Centrifugez le microtube pendant 3 min à 1 400 x g et éliminez le PBS.
- Pour dissocier les organoïdes du CCR adhérents, ajoutez 500 μL d’une solution de détachement cellulaire d’enzymes protéolytiques et collagénolytiques à la pastille cellulaire dans le tube et mélangez-la en tapotant doucement. Ensuite, laissez reposer les tubes pendant 10 min à température ambiante.
- Pipetez très doucement la suspension cellulaire avec 500 μL supplémentaires de FCS-DMEM à 1 % plusieurs fois dans un microtube de 1,5 mL pour dissocier grossièrement les cellules. La génération de cellules uniques à partir des organoïdes du CRC par pipetage brutal réduit considérablement la viabilité cellulaire. Ainsi, il est essentiel de laisser la masse de cellules visuellement détectable dans la suspension cellulaire en pipetant doucement dans un microtube de 1,5 mL.
- Centrifuger la suspension cellulaire pendant 3 min à 1 400 x g et retirer le surnageant.
- Résoudre la pastille cellulaire avec un mélange de 100 μL de stock de lentivirus 5x GFP (>10 8 TU/mL) et de 400 μl de milieu de culture organoïde CRC dans un microtube de 1,5 mL en tapotant doucement pour ajuster à une concentration de 5 x 105 cellules tumorales dissociées par 500 μl. Utiliser un hémocytomètre pour compter le nombre de cellules tumorales, Inclure des cellules simples et des groupes de cellules dans la suspension cellulaire, comme décrit ci-dessus (étape 3.3).
- Préparez une plaque artificielle à 12 puits recouverte d’une matrice extracellulaire, comme décrit à l’étape 3.2. Ensuite, placez 500 μl de la suspension cellulaire préparée à l’étape 5.7 sur la plaque et laissez-la pendant 18 h à 37 °C sous 5 % de CO2.
- Recueillir le milieu avec les cellules flottantes détachées de la plaque artificielle recouverte d’une matrice extracellulaire dans un tube de centrifugation de 1,5 mL. Centrifugez-le à 1 400 x g, puis retirez le surnageant et remettez en suspension la pastille dans 70 μl de matrice extracellulaire artificielle sur de la glace.
- Pour augmenter la viabilité des cellules du CCR, superposez la matrice extracellulaire artificielle contenant des cellules tumorales sur les organoïdes tumoraux attachés à la plaque à 12 puits recouverte d’une matrice extracellulaire artificielle, comme décrit à l’étape 3.5. Ensuite, incubez la plaque pendant 30 minutes dans un incubateur à 37 °C, 5 % de CO2 pour solidifier le revêtement artificiel de la matrice extracellulaire, puis cultivez-la avec 1 mL de milieu de culture organoïde CRC avec 1 % de FCS à 37 °C sous 5 % de CO2.
- Observez les cellules 3 jours après l’infection au microscope à fluorescence pour confirmer une positivité de la GFP de près de 100 % due à l’utilisation d’un titre élevé de particules lentivirales (voir Figure 2A).
- Cultivez les organoïdes du CCR pendant 7 à 10 jours pour accélérer la croissance cellulaire avant de les injecter chez les souris receveuses.
6. Génération de métastases par des organoïdes CRC marqués à la GFP chez les souris receveuses
Les procédures expérimentales de génération de métastases à l’aide des organoïdes du CRC marqués à la GFP sont décrites à la figure 1C (étape 7).
- Pour dissocier les organoïdes CRC marqués à la GFP dans la suspension cellulaire, récoltez-les mécaniquement à l’aide d’un grattoir cellulaire stérile et transférez-les dans un microtube de 1,5 ml, comme décrit ci-dessus (étape 5.1).
- Centrifugez le microtube pendant 3 min à 1 400 x g, retirez le milieu de culture et dissolvez la pastille cellulaire dans 500 μL de PBS en tapotant doucement.
- Centrifugez le microtube pendant 3 min à 1 400 x g et éliminez le PBS.
- Superposez 500 μL de la solution de détachement cellulaire sur la pastille de cellule dans le tube et mélangez-la en tapotant doucement. Ensuite, laissez le mélange reposer pendant 10 min à température ambiante pour dissocier enzymatiquement les organoïdes CRC adhérents, comme décrit ci-dessus (étape 5.4).
- Pipetez très doucement la suspension cellulaire avec 500 μL supplémentaires de FCS-DMEM à 1 % plusieurs fois dans un microtube de 1,5 mL pour dissocier grossièrement les cellules, comme décrit ci-dessus (étape 5.5). La génération de cellules uniques à partir des organoïdes du CRC par pipetage brutal réduit considérablement la viabilité cellulaire. Ainsi, laissez la masse de cellules visuellement détectable dans la suspension cellulaire en pipetant doucement dans un microtube de 1,5 ml.
- Centrifuger la suspension cellulaire pendant 3 min à 1 400 x g et retirer le surnageant.
- Pour établir un modèle murin de métastases spontanées de PDX CRC :
- Préparez une suspension cellulaire comprenant 5 x 105 cellules dans 50 μL de PBS avec 50 % de matrice extracellulaire artificielle par souris. Maintenez la suspension sur la glace avant utilisation. Utilisez un hémocytomètre pour compter les cellules cancéreuses, comme indiqué à l’étape 3.3.
- Anesthésie une souris avec l’inhalation d’isoflurane à l’aide de l’appareil d’anesthésie par inhalation pour petits animaux et désinfecte la peau avec de l’éthanol à 70 %. Assurez-vous que le rythme et la profondeur de la respiration sont normaux et que l’absence de réflexe de pincement des orteils permet une anesthésie adéquate. La pommade vétérinaire sur les yeux est une option pour prévenir la sécheresse oculaire sous anesthésie.
- Placez la souris NOG en position couchée sur la paillasse du laboratoire. Saisissez la muqueuse rectale à l’aide d’une pince à épiler stérile et retirez-la doucement de l’anus. Ensuite, injectez immédiatement la suspension cellulaire préparée à l’étape 6.7.1 dans la sous-muqueuse rectale de la souris à l’aide d’une seringue (taille de l’aiguille : 22 G). Régulièrement, 4 à 6 souris par groupe sont utilisées pour évaluer les résultats.