Établissement d’un modèle murin expérimental de métastases : implantation de cellules organoïdes CRC exprimant la GFP dans un modèle PDX pour détecter les micrométastases

Résumé

Source : Okazawa, Y. et al. Détection à haute sensibilité des micrométastases générées par la GFP Organoïdes transduits par lentivirus cultivés à partir d’une tumeur du côlon dérivée d’un patient. J. Vis. Exp. (2018).

Cette vidéo décrit le protocole de génération de métastases par les organoïdes CRC dérivés de PDX marqués avec le lentivirus GFP dans la rate d’une souris immunodéficiente. Les micrométastases cancéreuses colonisant d’autres organes peuvent être détectées à l’aide d’un microscope à fluorescence pour évaluer l’expression de la GFP.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Génération de métastases par des organoïdes CRC marqués à la GFP chez des souris receveuses

1. Pour établir un modèle expérimental de métastases de PDX du CCR :
   1. Préparez une suspension de cellules organoïdes du CCR comprenant 4 x 10⁴ cellules dans 50 μL de PBS par souris. Maintenez la suspension sur la glace avant utilisation. Utilisez un hémocytomètre pour compter les cellules cancéreuses. (Comptez le nombre de cellules tumorales, y compris les cellules uniques et les amas multicellulaires dans la suspension cellulaire).
   2. Anesthésie une souris avec l’inhalation d’isoflurane à l’aide de l’appareil d’anesthésie par inhalation pour petits animaux et désinfecte la peau avec de l’éthanol à 70 %. Assurez-vous que le rythme et la profondeur de la respiration sont normaux et que l’absence de réflexe de pincement des orteils permet une anesthésie adéquate. La pommade vétérinaire sur les yeux est une option, pour prévenir la sécheresse oculaire sous anesthésie.
   3. Placez la souris NOG anesthésiée en position couchée sur la paillasse du laboratoire. Faites une petite incision sur la partie inférieure du flanc gauche, puis coupez le péritoine pour exposer soigneusement la rate à l’aide de ciseaux stériles et d’une pince à épiler. Saisissez le tissu adipeux attaché à la rate à l’aide d’une pince à épiler stérile, puis injectez lentement 50 μL de la suspension cellulaire (préparée comme ci-dessus, étape 1.1) dans la rate. Assurez-vous que la suspension cellulaire est injectée de manière appropriée sans fuite vers l’extérieur, à partir de la rate. Régulièrement, 4 souris par groupe sont utilisées pour évaluer les résultats.
2. Placez toutes les souris sur un coussin chaud après l’opération et maintenez-les en position couchée sternale jusqu’à ce qu’une conscience suffisante soit rétablie. Une fois que les souris se sont complètement rétablies et sont capables de s’asseoir sur leurs quatre pattes, renvoyez-les dans leurs cages d’origine. Pour éviter la prédation, ne permettez pas la reproduction avec des animaux non opérés dans la même cage.
3. Vérifiez qu’il n’y a pas de fuite de suture et confirmez que les souris sont vivantes, dans le groupe traité chirurgicalement, le lendemain. Vérifiez les souris pour détecter des signes de maladie et mesurez la taille des tumeurs, à l’aide d’un pied à coulisse, chez toutes les souris une fois par semaine.
4. Observez les souris pour détecter les métastases spontanées (pendant des périodes allant jusqu’à 2,5 mois) et les métastases expérimentales (1 mois) après l’injection.
5. Sacrifiez les souris par anesthésie et luxation cervicale les jours indiqués. Disséquer les tumeurs primaires et divers tissus, y compris le foie et les poumons. Placez les tumeurs et les organes disséqués dans 5 ml de PBS glacé sur une boîte de Pétri de 10 cm et stockez-les sur de la glace.
6. Pour détecter les cellules organoïdes CRC positives à la GFP, observez les tissus disséqués au microscope à stéréofluorescence. Acquisition d’images avec une caméra CCD et préparation à l’aide d’un logiciel de traitement d’image standard

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Souris NOD/Shi-scid IL2Rγ null (NOG)	L’Institut central pour les animaux d’expérimentation, Kanagawa, Japon	Élever des souris mâles de 6 semaines dans des conditions exemptes de germes et d’agents pathogènes spécifiques
Clips de bobinage 2×10mm	Natsume manufacturing, Japon	#C-21-S	Autoclave avant utilisation
Taille de l’aiguille de la seringue Hamilton : calibre 22	Tokyo Science, Japon	Désinfecter avec de l’alcool à 70 % et du PBS stérile.
Tube conique de 50ml	Sumitomo Bakélite	MS-57500
microtube	Eppendorf	#0030120086	Autoclave avant utilisation
Hémocytomètre	Erma	#03-202-1
Milieu de culture organoïde CRC avec 1 % ou 5 % de FCS			DMEM/F-12 avec supplément GlutaMAX™ (Gibco #10565018) complété par 1 % ou 5 % de FCS, 100 U/ml de pénicilline, 100 μg/ml de streptomycine, 2 ng/ml hEGF et 10 μM Y27632, un inhibiteur de ROCK. Conserver à 4°C. Utiliser dans un délai de 1 mois.
un microscope à stéréofluorescence Zeiss Axioplan 2	Zeiss