Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Induction tumorale locale par infection adéno-crétique chirurgicale
- Préparation des animaux à la chirurgie
note: Pratiquement n’importe quelle mutation conditionnelle peut être induite via la méthode décrite ici. L’utilisation de mutations dans des gènes pertinents pour le cancer colorectal, tels que Apc, Kras ou Tp53, est recommandée. L’efficacité de la recombinaison Cre dépend de la taille de la construction à exciser. Les grandes séquences floxées sont excisées moins efficacement. La recombinaison de tous les allèles doit être confirmée dans les tumeurs par PCR.
- Pour le développement de tumeurs colorectales, utilisez un croisement des allèles conditionnels suivants pour un modèle de base de CCR (numéro de base de données MGI entre parenthèses) :
Apctm2Rak (MGI : 3688435)
Krastm4Tyj (MGI : 2429948)
Tp53tm2Tyj (MGI : 3039263)
- Si un allèle rapporteur de fluorescence est nécessaire (par exemple, pour détecter les micrométastases), utilisez l’allèle suivant :
Gt(ROSA)26Sortm6(CAG-ZsGreen1)Hze (MGI : 3809522)
note: Toutes les souches ci-dessus sont disponibles via le NCI Mouse Repository ou le Jackson Laboratory. Aucun jeûne n’est nécessaire car toutes les matières fécales restantes peuvent être évacuées avant l’infection adénovirale. Le jeûne préopératoire entraîne une mortalité périopératoire plus élevée et constitue un stress énorme pour les petits rongeurs.
- Utilisez le sévoflurane à 3 - 3,5 % en volume pour l’anesthésie générale. Une perte du réflexe de pincement de l’orteil indique une anesthésie suffisante.
- Avant la première incision, injecter 0,05 mg/kg de buprénorphine par voie sous-cutanée.
- Couvrez les yeux de la souris anesthésiée avec une pommade ophtalmique pour éviter la dessiccation de la cornée.
- Placez la souris en position couchée sur une petite table. Utilisez des rubans adhésifs non traumatisants pour retenir la souris.
- Rasez l’abdomen avec un rasoir électrique (une crème dépilatoire peut être utilisée alternativement) et désinfectez avec des tampons imbibés d’alcool ou d’iode. Utilisez le temps de contact recommandé par le fabricant.
- Couvrez le champ opératoire avec des champs stériles.
note: L’utilisation d’antibiotiques périopératoires est facultative et soumise aux directives de l’établissement.
- Utilisez des instruments stériles à usage unique ou stérilisés pour toutes les interventions chirurgicales.
- Laparotomie médiane et exposition du côlon
- À l’aide de ciseaux (les scalpels peuvent être utilisés en alternative), faire une incision médiane (~ 15 mm) sur la peau du bas-ventre.
- Prenez la musculature de la paroi abdominale avec une pince et incisez-la soigneusement avec des ciseaux, en ouvrant la cavité abdominale.
- Identifiez le côlon distal, ne le touchez qu’avec des forceps atraumatiques. Clamper le côlon à l’aide d’une pince délicate (p. ex., une pince vasculaire Micro Serrefine) à environ 15 mm en proximal de l’anus.
note: Portez une attention particulière à la vulnérabilité du côlon en tout temps. La perforation conduit inévitablement à la péritonite et à la septicémie et nécessite l’euthanasie de l’animal.
- Infection segmentaire du côlon par le virus Adéno-cre
- Insérez un tube flexible en téflon par voie transanale et avancez-le avec précaution jusqu’à ce qu’il atteigne l’occlusion de la lumière obtenue par la pince préalablement placée à 15 mm du bord anal. N’utilisez pas de force excessive car cela pourrait entraîner une perforation.
- Canulez le tube à l’aide d’une canule de 30 G, connectez une seringue standard de 1 ml et rincez le côlon avec une solution saline normale pour évacuer les matières fécales restantes. Cela peut nécessiter plusieurs ml de solution saline.
- Une fois que le côlon distal est vide, retirez le tube et remplacez-le par un tube en téflon frais et positionnez-le à nouveau directement distal par rapport à la pince comme décrit ci-dessus.
- Occlure le côlon à l’aide d’une deuxième pince distale de ~ 3 mm par rapport à la pince proximale (c.-à-d. au-dessus du tube inséré, à ~ 12 mm du bord anal), ce qui entraîne l’infection d’un segment isolé de 3 mm.
note: Pour l'occlusion distale du segment, les clips d'artère coronaire de Fogarty se sont avérés être les plus appropriés car ils sont caoutchoutés, conduisant à une occlusion serrée du côlon malgré le tube intraluminal entre les branches de la pince.
- À l’aide d’une deuxième seringue (standard de 1 ml avec une canule de 30 G), injectez soigneusement 50 à 80 μL de trypsine-EDTA à 0,25 % dans le segment du côlon clampé et laissez incuber pendant 10 min. Laissez la canule et la seringue attachées au tube en téflon pour éviter que le liquide ne s’échappe.
note: Le côlon doit être gonflé pour briser la barrière muqueuse et atteindre les cellules souches de la crypte, mais pas trop gonflé pour éviter la perforation du segment clampé.
- Tout d’abord, retirez la pince distale, puis le tube de trypsine.
- Rincer le côlon distal avec ~ 500 μL de solution saline normale pour éliminer la trypsine restante.
- Insérez un nouveau tube en téflon, remettez la pince distale en place et gonflez le segment du côlon avec 50 à 80 μL de solution adénovirale (1011 unités formant plaque (PFU)/mL dans une solution saline tamponnée au phosphate) et incubez pendant 30 min (Figure 2A).
note: Ne renversez pas la solution virale car le contact avec l’adéno-créance peut entraîner le développement d’une tumeur dans n’importe quel tissu de souris mutantes conditionnelles.
- Retirez les colliers et le tube.
- Fermeture de l’abdomen et récupération postopératoire
- Fermez la paroi abdominale à l’aide de sutures de course 6-0 rapidement résorbables (p. ex., polydioxanone (PDS)).
- Fermez la peau à l’aide de pinces chirurgicales.
- Placez la souris sur un coussin chauffant réglé à 38 °C jusqu’à ce qu’elle soit complètement rétablie de l’anesthésie.
- Administrer un autre bolus de 0,05 mg/kg de buprénorphine i.p. 12 h après la chirurgie, suivi d’un bolus de buprénorphine supplémentaire toutes les 12 h si nécessaire.
- Surveillez les souris au moins une fois par jour pour détecter des signes de détresse dus à la croissance tumorale.
2. Coloscopie
REMARQUE : Selon les mutations conditionnelles utilisées, l’infection adénovirale entraîne des tumeurs visibles par endoscopie dans un délai de 2 à 4 semaines. Par conséquent, effectuez la première coloscopie postopératoire 2 semaines après l’induction adénovirale et répétez l’opération toutes les 2 semaines. Un système disponible dans le commerce est recommandé pour la coloscopie murine.
- Préparation des animaux pour la coloscopie
note: Aucun jeûne n’est requis. Les matières fécales restantes sont généralement bien formées dans le côlon distal et peuvent être poussées au-delà de la tumeur lors de la coloscopie, ce qui rend inutile le processus stressant du jeûne répété.
- Utilisez le sévoflurane à 3 - 3,5 % en volume pour l’anesthésie générale. Une perte du réflexe de pincement de l’orteil indique une anesthésie suffisante.
- Couvrez les yeux des souris anesthésiées avec une pommade ophtalmique pour éviter la dessiccation de la cornée.
- Retenez les souris en position couchée sur une petite table.
- colonoscopie
- Insérez l’endoscope (diamètre 1,9 mm ; longueur 10 cm) dans le tractus intestinal par l’anus et insufflez soigneusement de l’air sous contrôle visuel pour distendre le côlon. N’insufflez pas plus d’air que nécessaire pour l’examen.
note: Pour l’insufflation d’air, la pompe à air anti-buée du système de coloscopie peut être utilisée. S’il n’y a pas de pompe à air antibuée, il est possible d’utiliser toute autre pompe à air avec des réglages de très basse pression ou de l’air sous pression avec un réducteur de pression délicat. Le dioxyde de carbone (CO2) entraîne facilement l’acidose chez les petits rongeurs et doit donc être évité.
- Poussez délicatement l’endoscope vers l’avant jusqu’à ce qu’une lésion de la muqueuse dans le côlon distal puisse être identifiée (Figure 1A - 1D).
- Enregistrez les images endoscopiques pour une évaluation ultérieure. Un système de notation endoscopique pour les tumeurs intraluminales a déjà été décrit.
- Retirez délicatement l’endoscope et placez la souris sur un coussin chauffant réglé à 38 °C jusqu’à ce qu’elle se soit complètement remise de l’anesthésie.
