1. Dosage de la liaison des microtubules
- Pour le test de liaison des microtubules, ajouter ~1 x 106 cellules HCT 116 dans des boîtes de culture tissulaire de 100 mm contenant le milieu essentiel minimum (MEM) complété par 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) et 1 % de pénicilline-streptomycine. Après une journée de culture, les cellules atteindront 60-70 % de confluence.
- Préparez 1X (2 mL) tampon PEM à partir de 10X tampon PEM stocké à 4 °C en ajoutant 20 μM (40 μL) de paclitaxel et 1 mM (20 μL) de GTP. Prenez le stock de microtubules (MT) du congélateur à -80 °C et le stock de travail à E. coli tau du congélateur à -20 °C.
- Préparer les échantillons conformément au tableau 1.
- Incuber à 37 °C pendant 30 min. Ultracentrifugeuse à 25 °C pendant 60 min à 100 000 x g.
- Transvasez 120 μL de surnageants contenant du tau non lié dans des tubes propres et étiquetés.
- Ajouter 120 μL (même volume que le surnageant) de tampon d’échantillon 5X à la pastille contenant du tau lié et bien mélanger. Transférez la solution dans des tubes propres étiquetés et mélangez soigneusement.
- Mesurez la concentration en protéines par le test Bradford à l’aide de kits commerciaux de dosage des protéines.
note: Lors de la préparation des échantillons, utiliser le volume de solution (étape 1.6) pour préparer les échantillons de pastille et de surnageant.
- Préparez des échantillons de concentration protéique équivalente et ajoutez 4x tampon de chargement de gel SDS fraîchement préparé contenant du DTT (400 mM).
note: Les échantillons peuvent être conservés à -20 °C à ce stade.
- Incuber les échantillons sur un bloc de chaleur à 100 °C pendant 5 min. Mélanger les échantillons à l’aide d’un vortex. Laisser refroidir à température ambiante pendant ~10-15 min.
- Assemblez un système d’électrophorèse pour faire fonctionner un gel de polyacrylamide à 10 % par SDS-PAGE.
- Chargez 10 μg de protéines (13 μL d’échantillon) par puits sur un gel de polyacrylamide à 10 %. Chargez l’échelle de poids moléculaire.
- Après avoir chargé l’échantillon, connectez les électrodes positive et négative du système d’électrophorèse à une source d’alimentation pour maintenir une tension constante. Au départ, commencez à 70 V pendant 20 minutes pour déplacer les échantillons de protéines du gel d’empilement dans le gel de résolution. Ensuite, augmentez la tension à 125 V et faites fonctionner le gel pendant environ 70 à 120 minutes jusqu’à ce que les échantillons et l’échelle de protéines atteignent la fin du gel.
- Une fois l’électrophorèse terminée, transférez le gel sur une membrane PVDF à l’aide d’un système d’électrobuvardage humide. Transfert pendant ~100 min à 100 V.
- Marquez la tache en faisant une petite entaille sur le côté de l’échelle de poids moléculaire. Utilisez une feuille de plastique transparente et un cutter bien aiguisé pour couper le tache.
- Bloquer la membrane dans un tampon de blocage BSA à 4 % pendant 90 min à température ambiante.
- Incuber le transfert dans une solution d’anticorps primaires (anti-tau à 1:5 000) à 4 °C pendant la nuit. Lavez la tache au PBST quatre fois, pendant 7 minutes chacune.
- Préparez la solution d’anticorps secondaires appropriée (IgG anti-souris de chèvre à 1:5 000) et incubez le transfert pendant 90 min à température ambiante. Laver au PBST quatre fois, pendant 7 minutes chacune.
- Développer le transfert à l'aide d'un kit de chimiluminescence selon les recommandations du fabricant. Recouvrez la tache d’une pellicule plastique transparente. Acquérir des images par un système d’imagerie par chimiluminescence pour la chimiluminescence avec un logiciel approprié.
Tableau 1 : Préparation de l’échantillon pour le dosage de la liaison des microtubules.
| échantillon | nom | Microtubule nécessaire | Protéines principales nécessaires | PEM-GTP-PTX |
| 1 | HCT 116-Contrôle (6,21 μg/μl) | 2 μl | 9,66 μl (60 μg) | 108,34 μl |
| deux | HCT 116-Curcumine 10 μM (4,81 μg/μl) | 2 μl | 16,63 μl (80 μg) | 101,37 μl |
| 3 | HCT 116-Curcumine 20 μM (3,28 μg/μl) | 2 μl | 30,49 μl (100 μg) | 87,51 μl |
| 4 | HCT 116-LiCl 25 mM (5,43 μg/μl) | 2 μl | 18,42 μl (100 μg) | 99,58 μl |
| 5 | E. coli tau | 2 μl | 1 μl de tau-352 | 117 μl |
| 6 | MT uniquement | 2 μl | L | 118 μl |
| | | | 120 μl chacun |
