Isolement des CTC à partir d’un échantillon de sang total : une méthode pour obtenir des CTC à partir d’un modèle murin de cancer colorectal

Résumé

Source : Kochall, S., et al. Isolement des cellules tumorales circulantes dans un modèle murin orthotopique de cancer colorectal. J. Vis. Exp. (2017).

Cette vidéo décrit un protocole détaillé pour isoler les cellules tumorales circulantes à partir de l’échantillon de sang entier d’un modèle murin de tumeur colorectale euthanasiée. Ces CTC isolés peuvent être cultivés et utilisés pour l’analyse en aval prévue.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Isolement des cellules tumorales circulantes à partir d’échantillons de sang total

NOTE : Obtenir du sang par ponction cardiaque transcutanée sur des souris anesthésiées, suivie d’une euthanasie. Idéalement, 1 000 μL de sang sont aspirés dans une seringue préremplie de 100 μL d’un anticoagulant (acide éthylènediaminetétraacétique [EDTA] ou héparine). Utilisez un anticorps anti-EpCAM (molécule d’adhésion des cellules épithéliales) humain pour identifier les CTC. Cela fonctionne très bien si des lignées cellulaires épithéliales humaines sont utilisées dans le modèle murin. Pour d’autres applications, différents anticorps peuvent être nécessaires.

1. Enrichissement CTC :
   1. Préremplissez les tubes de 15 ml avec un milieu à gradient de densité de 5 ml et transférez soigneusement le sang dans le tube de 15 ml.
   2. Centrifuger (30 min à 300 x g sans freiner) et retirer soigneusement le surnageant supérieur.
   3. Versez le reste dans un tube neuf de 15 ml et centrifugez-le (15 min, 300 x g avec frein).
   4. Récupérez l’interphase contenant les cellules mononucléées (jetez le reste) et lavez les cellules deux fois avec du PBS.
   5. Remettez la pastille en suspension dans 200 μL de PBS/1 % d’EDTA et ajoutez 4 μL d’anticorps EpCAM. Incuber 20 min sur glace dans l’obscurité.
2. Criblage et cueillette
   1. Préparez le tampon suivant (ci-après appelé tampon de cueillette) : PBS + 10 % de sérum de veau fœtal (SCF) + 1 % de pénicilline/streptomycine (1 %) + 0,8 % d’EDTA.
   2. À l’aide d’un stylo PAP, dessinez un cercle de ~1 cm dans une boîte de Pétri stérile de 6 cm (empêche le liquide de se disperser dans la boîte), et placez une pipette de 700 μL de tampon de prélèvement dans ce cercle.
   3. Ajoutez 50 μL de suspension cellulaire dans le tampon de prélèvement de 700 μL à l’intérieur du cercle. Vérifiez la densité des cellules au microscope. Divisez l’échantillon en différents plats s’il est trop dense.
   4. Attendez que les cellules se stabilisent (~5 min).
   5. Dépister la goutte de suspension cellulaire pour les cellules colorées (= EpCAM-positive).
   6. Une fois qu’une cellule est trouvée, prélevez-la à l’aide du micromanipulateur et placez-la dans un tampon de 50 μL en fonction de l’analyse en aval prévue (p. ex., tampon d’extraction d’ARN ou milieu de culture).
   7. En fonction des analyses en aval prévues, isolez les cellules et/ou le milieu négatifs EpCAM en tant que témoins négatifs.
   8. Procéder aux analyses en aval (p. ex., culture cellulaire, PCR).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Gradient de densité moyen – Ficoll	StemCell - Lymphoprep	Référence 7801
Alexa Fluor 488 anti-humain CD326 (EpCAM) Clone d’anticorps 9C4	BioLégende	Référence 324210
Alexa Fluor 488 anti-souris CD326 (EpCAM) Clone d’anticorps G8.8	BioLégende	Référence 118210
Boîte de Pétri, ø 60 x 15 mm, 21 cm², Évent	Greiner bio-one	628102
Microscope de culture cellulaire à fluorescence	Leica
Micromanipulateur Transferman 4r	Eppendorf
CellTram Air	Eppendorf		Pompe d’aspiration connectée au micromanipulateur
Extracteur de microélectrode universel Dmz	Société Dagan		nécessaire à la fabrication de microcapillaires pour l’aspiration de cellules uniques
Capillaires en verre prismatique	Société Dagan
Stylo PAP	Abcam
Saline tamponnée au phosphate de Dulbecco	Life Technologies GmbH	14190169	tampon de prélèvement
Sérum de veau fœtal (FCS)	BIOCHROM AG	S 0115	tampon de prélèvement
Pénicilline/Streptomycine (PenStrep)	Life Technologies GmbH	15140122	tampon de prélèvement
Edta	Roth	Référence 8040.1	tampon de prélèvement
Immunohistochimie
Clone 9C4 de l’anticorps anti-humain CD326 purifié (EpCAM)	BioLégende	324201	Immunohistochimie EpCAM
HRP lapin anti-souris IgG	Abcam	AB97046	Immunohistochimie EpCAM