$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Préparation organotypique :
Préparation du gel organotypique imprégné de fibroblastes :
- Préparer une suspension de cellules de fibroblastes contenant 5 x 105 cellules par organotypique dans du DMEM complété par 10 % de FCS et 292 μg/ml de L-Glutamine.
- Préparez les gels organotypiques sur glace dans les proportions suivantes :
- • 7 volumes de Rat-Tail Collagen : mélange de Matrigel (1:1)
- • 1 volume de DMEM 10x filtré
- • 1 volume de FCS
- • 1 volume de suspension de cellules de fibroblastes contenant 5 x 105 fibroblastes
Pour 9 gels (1 ml par gel), préparez 10 ml et mélangez doucement pour éviter les bulles.
- Ajouter 1 ml dans chaque puits d’une plaque de 24 puits et incuber pendant 1 heure à 37 °C dans une atmosphère humidifiée pour permettre aux gels de prendre. Après 1 heure, ajoutez 1 ml de DMEM (10 % FCS)/Glut sur les gels et retournez dans l’incubateur pendant la nuit.
- Le lendemain, aspirez le milieu du haut des gels et mettez en plaque 1 ml de milieu contenant 5 x 105 cellules épithéliales du CCR.
Préparation des feuilles de nylon enduites de gel :
- Préparez à l’avance des feuilles de nylon stériles autoclavées de 1,5 cm x 1,5 cm.
- À l’aide d’une pince stérile, placez le nombre requis de feuilles de nylon dans une boîte de culture de 10 cm (généralement 4 feuilles de nylon peuvent être logées par boîte).
- Préparez le gel sur glace dans l’ordre suivant (un volume total de 250 μl est nécessaire par feuille de nylon) :
- • 7 volumes de collagène Rat-Tail
- • 1 volume de DMEM 10x filtré
- • 1 volume de FCS
- • 1 volume de DMEM 10 % FCS/Glut
- Si la solution est jaune, neutraliser en ajoutant 0,1 M de NaOH dans des aliquotes de 50 μl jusqu’à ce que la solution devienne rose.
- Ajoutez 250 μl de cette solution à chaque feuille de nylon et incubez à 37 °C dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO2 pendant 30 min pour permettre au gel de prendre.
- Maquillage : solution de glutaraldéhyde à 1 % dans du PBS. Ajouter 10 ml dans chaque plat de culture de 10 cm une fois que le gel a pris et incuber à 4 °C pendant 1 h.
- Laver les feuilles de nylon 3x en PBS et 1x en DMEM (10 % FCS)/Glu et incuber toute la nuit dans du DMEM/Glu à 4 °C.
Levage de gels organotypiques sur des grilles d’acier pour l’invasion :
- Préparez à l’avance les grilles d’échafaudage en pliant des tôles d’acier inoxydable en une formation de trépied. Autoclave avant utilisation.
- Utilisez des pinces stérilisées à l’éthanol pour placer une grille d’acier dans chaque puits d’une plaque à six puits.
- Placez une feuille de nylon enduite de gel avec le côté collagène vers le haut, sur chaque grille.
- Transférez soigneusement les gels organotypiques de la plaque à 24 puits sur la feuille de nylon en relief à l’aide d’une spatule stérilisée à l’éthanol.
- Remplissez le puits avec du DMEM 10 % FCS/Glut complété par 10 % de FCS jusqu’à ce que la feuille de nylon soit en contact avec le milieu mais pas immergée. Assurez-vous que le milieu ne touche pas le gel organotypique.
- Incuber pendant 14 jours à 37 °C dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO2, en remplaçant le média tous les 2 jours.
2. Fixation organotypique
- Retirez tout l’organotypique, y compris la feuille de nylon, du puits et placez-le sur du film alimentaire.
- Coupez en deux la feuille d’organotypique et de nylon à l’aide d’un scalpel jetable propre et fixez les deux moitiés dans du formaldéhyde pendant 24 heures à température ambiante.
- Remplacez le formaldéhyde par de l’éthanol à 70 % après 24 heures et laissez reposer toute la nuit avant de l’enrober dans la paraffine, de sectionner et de colorer.
3. Microdissection laser de la marge invasive
- Section jusqu’à 10 μm d’épaisseur sur des lames montées sur membrane.
- Déparaffiniser les sections en appliquant du xylène pendant 1 min, puis retirer le xylène et fixer 75 % d’éthanol pendant 1 minute supplémentaire.
- Enlever l’éthanol et colorer avec une solution de Cresyl Violet à 0,125 % pendant 1 min. Cresyl Violet met en évidence les cellules épithéliales et permet une discrimination facile du stroma.
- Retirez le violet de crésyle et appliquez de l’éthanol à 100 % pendant 1 minute supplémentaire avant de rincer à l’éthanol à 100 %. Laissez les diapositives sécher à l’air libre pendant 30 min.
- Effectuez une microdissection laser à l’aide de la plateforme choisie (par exemple, le système Leica AS).
- Placez la lame de verre avec la section colorée à microdisséquer face vers le bas sur la platine du microscope.
- Montez un tube de microcentrifugation de 0,5 ml dans la cassette de collecte et ajoutez 50 μl de tampon de lyse cellulaire (par exemple, un tampon de lyse d’ADN, d’ARN ou de protéine) dans le capuchon dans lequel le tissu microdisséqué s’accumulera.
- En vision directe, utilisez le joystick pour identifier le tissu d’intérêt. À l’aide de l’interface du logiciel, annotez la section organique colorée, en mettant en évidence les cellules à microdisséquer sur le front d’invasion tumorale.
- Demandez au laser de tirer, ce qui devrait à la fois découper la section en surbrillance et propulser le tissu microdisséqué dans le capuchon du tube de la microcentrifugeuse.
- Une fois qu’une quantité suffisante de matériau a été collectée, éjectez la cassette de collecte, fermez le tube de microcentrifugation et tournez doucement pour tirer le tampon de lyse vers le fond du tube.
- Placez les échantillons sur de la glace jusqu’à ce que la microdissection soit terminée. Traiter les échantillons par une méthode appropriée pour extraire l’analyte d’intérêt.