Dosage de la cytométrie de traction : une méthode pour quantifier la force de traction exercée par les cellules cancéreuses sur l’ECM

Résumé

Source : Ali, M. Y., et al. Isolement de cellules tumorales primaires du côlon humain à partir de tissus chirurgicaux et leur culture directement sur des substrats élastiques souples pour la cytométrie de traction. J. Vis. Exp. (2015).

Cette vidéo décrit le test de microscopie à force de traction. Le test détermine la traction cellulaire des cellules cancéreuses du côlon humain sur la matrice extracellulaire présente sur un hydrogel élastique mou ayant des billes fluorescentes intégrées. Le déplacement résultant des billes fluorescentes est mesuré à l’aide d’un logiciel approprié.

Protocole

1. Essai de microscopie à force de traction

1. Réchauffer une solution de trypsine-EDTA/SDS à 0,25 % à 37 °C dans un bain-marie pendant 10 minutes avant le début des expériences de traction.
2. Retirer un gel (fonctionnaliser les gels de PA et le verre avec des molécules ECM, fibronectine humaine à une concentration de 50 μg/ml) de l’incubateur de culture cellulaire à la fois et à l’endroit sur la platine du microscope inversé fluorescent (grossissement 32X).
3. Recherchez une seule cellule dans le champ de vision. Retirez le couvercle de la boîte de Pétri.
4. Prenez une image en contraste de phase de la cellule (p. ex., figure 1).
5. Basculez le mode d’imagerie sur la fluorescence et sélectionnez le filtre approprié. Ne déplacez pas la platine du microscope ou l'échantillon pendant ce temps.
6. Prenez une image des billes fluorescentes déplacées par la traction cellulaire (Figure 2C).
7. Ajoutez 1 ml de solution de trypsine/SDS dans la boîte de Pétri pour détacher la cellule du gel. Ne déplacez pas la platine du microscope ou l'échantillon pendant ce temps. Prenez également une image de contrôle de la cellule pour assurer l’élimination complète du gel.
8. Prenez une image de référence (force nulle) des perles après la suppression de la cellule.
9. Répétez les étapes 1.2 à 1.8 pour tous les autres gels.
10. Faites une pile d’images à l’aide d’ImageJ à partir des deux images acquises aux étapes 1.6 et 1.8 pour chaque cas. Pour générer la pile d’images, utilisez la séquence de commandes suivante dans ImageJ après avoir ouvert les images : Image → Stacks → Images to stack.
11. Pour obtenir le champ de déplacement et la traction, utilisez les plugins ImageJ en suivant les méthodes publiées. Obtenez des codes et des tutoriels détaillés pour ces plugins en utilisant le lien suivant : https://sites.google.com/site/qingzongtseng/imagejplugins.
    1. Alignez les images dans la pile à l’aide du plugin 'Template Matching'. Utilisez la séquence de commandes suivante dans ImageJ après avoir ouvert la pile d’images générée à l’étape 1.10 : Plugins → Template Matching → Aligner les tranches dans la pile → OK. Enregistrez la pile d’images en conséquence. Utilisez cette nouvelle pile d’images dans les étapes suivantes.
    2. Obtenez le champ de déplacement à l’aide du plugin PIV (vélocimétrie par image de particules) (Figure 2D). Utilisez la séquence de commandes suivante après avoir ouvert la pile d’images enregistrée à l’étape 1.11.1 : Plugins → PIV → Iterative PIV (Basic) → OK → Acceptez cette PIV et la sortie → Ok. Enregistrez la sortie PIV dans le même répertoire que dans la pile d’images d’origine. Utilisez-le comme entrée à l’étape suivante.
    3. Enfin, utilisez le plugin FTTC (Fourier transform traction cytometry) pour obtenir la carte de traction (Figure 2E). Utilisez la séquence de commandes suivante : Plugins → FTTC → Insérez les propriétés du matériau, c’est-à-dire le module de Young et le rapport de Poisson du gel PA → OK → Sélectionnez le fichier de sortie PIV enregistré à l’étape 1.11.2 → OK. Enregistrez les résultats FTTC dans le même répertoire que dans la pile d’images et la sortie PIV.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Pbs	Lonza	17-516F
trypsine	Worthington	LS003736
acrylamide	Sigma-Aldrich	A4058
N-méthylènebisacrylamide (bis)	Sigma-Aldrich	M1533
Fibronectine humaine	BD biosciences	354008
Perles fluroscentes de 0,1 μm	Technologies du vivant	F8801
0,25 % Trypsine-EDTA	Technologies du vivant	Référence 25200-056
Couvercles en verre de 12 mm2	Corning	Référence 2865-12