Essai d’organisation du cytosquelette et de l’adhésion focale : une méthode basée sur l’immunofluorescence pour étudier l’adhésion cellulaire et la propagation sur des substrats

Résumé

Source : Ali, M. Y et al., Isolement de cellules tumorales primaires du côlon humain à partir de tissus chirurgicaux et leur culture directement sur des substrats élastiques souples pour la cytométrie de traction. J. Vis. Exp. (2015)

Cette vidéo décrit la technique d’étude du cytosquelette et des adhérences focales dans les cellules cancéreuses primaires du côlon humain afin de comprendre ses variations en fonction de la rigidité du substrat. Cette culture de cellules cancéreuses sur des substrats mous et durs permet diverses mesures biophysiques en aval pour le pronostic du cancer.

Protocole

1. Tests de microscopie par immunofluorescence

1. Prenez les substrats avec des cellules à immuno-marquer dans le capuchon laminaire et retirez le milieu de culture.
2. Rincer les substrats avec du PBS et fixer les cellules avec 4 % de paraformaldéhyde dans du PBS pendant 20 min à RT.
3. Lavez les supports avec du PBS trois fois (5 min à chaque fois). Par conséquent, incubez les substrats avec un amplificateur de signal de 500 μl pendant 30 min et rincez avec du PBS.
4. Incuber des cellules avec l’anticorps monoclonal anti-vinculine à une dilution de 1:250 dans du PBS pendant 45 min à RT. Ensuite, lavez les supports avec du PBS 3 fois (5 min à chaque fois).
5. Incuber les échantillons avec l’anticorps secondaire Alexa Fluor 488 chèvre IgG anti-souris à une dilution de 1:200 dans du PBS à RT pendant 30 min. Laver les substrats avec du PBS 3 fois (5 min à chaque fois).
6. Pour visualiser la structure de l’actine F, incubez des cellules avec des conjugués de phalloïdine TRITC à une concentration de 50 μg/ml pendant 45 min à RT. Ensuite, lavez les supports avec du PBS 3 fois (5 min à chaque fois).
7. Imagez les échantillons à l’aide d’un microscope laser confocal à balayage (figure 1A-1D).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Réactifs
Pbs	Lonza	17-516F
paraformaldéhyde	Sciences de la microscopie électronique	RT15710
Amplificateur de signal	Technologies du vivant	I36933
Anticorps monoclonal anti-vinculine	Sigma-Aldrich	Réf. V9131
Alexa Fluor 488 chèvre anti-souris IgG	Technologies du vivant	A11001
Conjugués de la phalloïdine TRITC	Sigma-Aldrich	P1951
matériaux
Couvercles en verre de 12 mm2	Corning	Référence 2865-12