Essai d’organisation du cytosquelette et de l’adhésion focale : une méthode basée sur l’immunofluorescence pour étudier l’adhésion cellulaire et la propagation sur des substrats

1. Tests de microscopie par immunofluorescence

1. Prenez les substrats avec des cellules à immuno-marquer dans le capuchon laminaire et retirez le milieu de culture.
2. Rincer les substrats avec du PBS et fixer les cellules avec 4 % de paraformaldéhyde dans du PBS pendant 20 min à RT.
3. Lavez les supports avec du PBS trois fois (5 min à chaque fois). Par conséquent, incubez les substrats avec un amplificateur de signal de 500 μl pendant 30 min et rincez avec du PBS.
4. Incuber des cellules avec l’anticorps monoclonal anti-vinculine à une dilution de 1:250 dans du PBS pendant 45 min à RT. Ensuite, lavez les supports avec du PBS 3 fois (5 min à chaque fois).
5. Incuber les échantillons avec l’anticorps secondaire Alexa Fluor 488 chèvre IgG anti-souris à une dilution de 1:200 dans du PBS à RT pendant 30 min. Laver les substrats avec du PBS 3 fois (5 min à chaque fois).
6. Pour visualiser la structure de l’actine F, incubez des cellules avec des conjugués de phalloïdine TRITC à une concentration de 50 μg/ml pendant 45 min à RT. Ensuite, lavez les supports avec du PBS 3 fois (5 min à chaque fois).
7. Imagez les échantillons à l’aide d’un microscope laser confocal à balayage (figure 1A-1D).