Préparation de blocs de tissus cutanés congelés : un protocole pour conserver des échantillons de mélanome cutané à partir de la peau dorsale murine

Dans cet article

Résumé

Source : Moon, H., et al. Contrôle spatial et temporel de l’initiation du mélanome murin à partir de cellules souches de mélanocytes mutants. J. Vis. Exp. (2019)

Cette vidéo décrit le protocole détaillé d’isolement de la peau dorsale murine contenant un mélanome, suivie d’une cryo-intégration pour préparer un bloc de tissu cutané congelé. Le bloc de tissu cryo-intégré peut être sectionné et examiné au microscope pour étudier la progression du mélanome.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Traitement des tissus

Isolation cutanée
1. Procurez-vous les éléments suivants avant de commencer : des instruments de nécropsie, du papier filtre et des serviettes en papier.
2. Euthanasiez les souris selon les protocoles approuvés et confirmez la mort avant de procéder.
3. À l’aide d’une tondeuse à cheveux, rasez les poils de la zone de la peau dorsale. Brossez légèrement la zone avec un mouchoir non pelucheux pour dégager la zone.
4. Faites une petite incision avec des ciseaux pointus juste au-dessus de la base de la queue.
5. Insérez de gros ciseaux émoussés dans l’incision et séparez les tissus conjonctifs sous-cutanés.
6. Isolez soigneusement la région cutanée d’intérêt en coupant avec des ciseaux tranchants le long du bord du tissu.
7. Placez le tissu cutané sur une serviette en papier propre et utilisez une pince émoussée pour étirer la peau afin qu’elle adhère à la serviette et soit tendue. Cette étape sert à fournir un support supplémentaire au tissu afin qu’il puisse être manipulé et traité tout en conservant sa forme.
  note: Veillez à ne manipuler que les régions extérieures du tissu cutané, car les pinces peuvent causer des dommages à la peau qui peuvent être vus histologiquement.
Fixation tissulaire
1. Pliez un morceau de papier filtre en deux et étiquetez-le de manière appropriée. Placez la peau avec un essuie-tout dans le papier plié immédiatement adjacent au pli, en vous assurant que l’échantillon est lisse et non plié ou froissé. Scellez le papier filtre en agrafant les côtés ouverts, puis coupez-le afin que le papier restant puisse être utilisé pour les futurs échantillons.
  note: Cette étape est réalisée de manière à ce que la peau conserve sa forme lors de la fixation.
2. Immerger complètement l’échantillon de tissu dans du formol tamponné à 10 % pendant 3 à 5 h à température ambiante ou toute la nuit à 4 °C.
3. Après la fixation, retirez les échantillons de formol, lavez-les dans de l’eau déminéralisée (2 x 5 min chacun) et procédez à la fabrication de blocs de tissus. Retirez soigneusement toute matière résiduelle du tissu cutané (c’est-à-dire le papier résiduel).
Fabrication de blocs de tissus congelés (figure 1)
1. Coupez les bords de l’échantillon de peau pour qu’ils ne soient pas déchiquetés, puis faites 3 coupes sagittales. La largeur de ces bandes ne doit pas dépasser la hauteur du cryomoule (5 mm). Ensuite, faites des coupes transversales pour avoir des morceaux de peau qui ne sont pas plus longs que la largeur du cryomoule (20 mm) et qui peuvent être encastrés. Répétez l’opération avec la moitié restante de la peau dorsale, ou conservez le tissu pour d’autres utilisations (alternativement, conservez la moitié avant la fixation).
  note: Il est important de garder les morceaux de peau dans la bonne orientation.
2. Orientez le cryomoule (25 x 20 x 5 mm³) en orientation portrait et placez 4 à 5 morceaux de peau sur l’OCT. Une fois que toutes les pièces sont en place, utilisez 2 paires de pinces fines pour amener le bord long de la peau au fond du cryomoule. La peau doit maintenant être debout dans l’OCT perpendiculairement à la base du moule. Veillez à minimiser la formation de poches d’air à l’intérieur de l’OCT au cours de cette étape (Figure 1).
3. Remplissez le moule d’OCT jusqu’à la deuxième lèvre et placez-le sur la surface plane de la glace sèche. Utilisez une pince pour ajuster les morceaux de peau qui auraient pu se déplacer pendant le transfert lorsque le bloc commence à geler. Une fois la couche inférieure solidifiée, la manipulation des tissus sera impossible.
4. Coupez des lames de 8 à 10 μm pour l’analyse.
Fabrication de blocs de tissu Formalin Fixed Paraffin Embedded (FFPE)
1. Placez 2 morceaux de peau fixe dans une cassette étiquetée et déshydratez-les à des concentrations croissantes d’éthanol (75 % d’éthanol pendant 30 min, 85 % pendant 30 min, 90 % pendant 30 min, 95 % pendant 30 min, 100 % pendant 2 x 30 min, xylène ou substitut de xylène pendant 2 x 30 min). Incuber avec de la paraffine à 58-60° C, d’abord pendant 30 min, puis toute la nuit.
2. Enfoncez le tissu dans un moule à moulage en acier inoxydable^{de 24} x 24 mm avec de la paraffine liquide et solidifiez-le à -5 °C. L’orientation des tissus doit être similaire à celle des blocs de tissus congelés afin que les sections longitudinales de plusieurs follicules pileux puissent être visualisées (Figure 1).
3. Une fois la paraffine solidifiée, retirez le moule et coupez-le en sections de 5 à 10 μm pour l’analyse.

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Résultats

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Figure 1 : Isolement des tissus cutanés et cryo-intégration. Après l’euthanasie, rasez la région dorsale de la peau d’intérêt de la souris et intégrez la peau dans un cryomoule contenant de l’OCT. La ligne pointillée sur la souris représente la ligne médiane. En règle générale, 3 ou 4 morceaux de peau peuvent être isolés avec le segment de ligne 3-4 le long de la ligne médiane ; L’une de ces p...