Modélisation de xénogreffes dérivées de patients : une technique pour générer des modèles de souris de mélanome

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Traitement du tissu tumoral pour l’implantation chez la souris

1. Excision chirurgicale ou biopsie chirurgicale du traitement tissulaire
   1. Transférez le tissu dans une boîte de Pétri stérile et séparez autant que possible le tissu tumoral du tissu normal environnant.
   2. Retirez autant que possible le tissu nécrotique (généralement identifié comme du tissu blanchâtre pâle situé au centre de la tumeur) de la tumeur restante.
   3. À l’aide d’un scalpel, subdivisez un morceau de tumeur initial en morceaux à peu près égaux (~3 mm x 3 mm) pour l’implantation chirurgicale de souris (Figure 1).
   4. Si vous pouvez éventuellement disposer de suffisamment de tissu tumoral, congelez instantanément le tissu pour les tests en aval (séquençage de l’ARN [RNASeq], séquençage de l’exome entier [WES], etc.).
   5. Faites une boue tumorale en hachant le tissu tumoral à l’aide d’une technique de lames croisées avec deux lames de scalpel. Émincez les morceaux de tumeur aussi finement que possible pour former une boue, qui est maintenant prête pour l’implantation chirurgicale de souris.
   6. Alternativement, si le tissu tumoral est trop dur pour la dissociation mécanique, utilisez une procédure de dissociation de la digestion pour former une bouillie semblable à un gel et une suspension unicellulaire pour l’implantation et/ou l’injection.
      1. Émincez les morceaux de tumeur aussi finement que possible pour former une boue.
      2. Mettre la suspension dans un tube de 50 mL avec une solution saline équilibrée de Hank (HBSS)^-/- froide (sans Ca⁺⁺ et Mg⁺⁺), puis centrifuger la pastille à 220 x g pendant 4 min à 4 °C.
      3. Remettre la suspension dans 10 mL de milieu de digestion frais réchauffé (200 U/mL de collagénase IV + 5 mM de CaCl₂ + 50 U/mL de DNase dans ^HBSS-/-) pour 1 g de tissu tumoral.
      4. Placez le tube dans un bain-marie à 37 °C pendant 20 min et mélangez vigoureusement toutes les 5 minutes à l’aide d’une pipette jetable.
      5. Laver avec jusqu’à 50 mL de ^HBSS-/-, puis centrifuger à 220 x g pendant 4 min à 4 °C.
      6. Ajouter 5 mL de TEG préchauffé (0,025 % de trypsine + 40 μg/mL d'éthylène glycol-bis(β-aminoéthyl éther)-N,N,N',N'-acide tétraacétique [EGTA] + 10 μg/mL d'alcool polyvinylique [PVA]) pour 1 g de tissu tumoral, remettre doucement en suspension/agiter et placer le tube à 37 °C pendant 2 min sans mélanger.
      7. Ajouter au moins 1 volume égal de milieu de coloration à froid (1 % d’albumine sérique bovine [BSA] + 10 mM d’acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinethanasine [HEPES] + 1 x pénicilline-streptomycine dans le milieu L15) pour tremper la trypsine et centrifuger à 220 x g pendant 4 min à 4 °C.
      8. Remettez l’échantillon en suspension dans 10 mL de média de coloration pour 1 g de tissu tumoral et filtrez-le à travers une passoire cellulaire de 40 μm pour obtenir une suspension unicellulaire pour l’injection chez la souris (Figure 1).
      9. La boue restant sur le dessus de la crépine cellulaire peut également être collectée pour l’implantation chirurgicale de souris.
2. Implantation et injection de tumeurs chez la souris
   1. Implantation d’exérèse chirurgicale ou de biopsie tissulaire chirurgicale
      note: Assurez-vous que tous les instruments chirurgicaux sont stériles par autoclave ou en utilisant des instruments jetables pré-stérilisés.
      1. Rasez les poils du bas du dos des souris mâles ou femelles NSG de 6 à 8 semaines, en laissant une zone d’environ 1,5 cm x 3 cm sans poils. Anesthésiez les souris à l’aide d’isoflurane et confirmez en pressant doucement le pied pour tester la réactivité. Utilisez une pommade vétérinaire sur leurs yeux pour prévenir la sécheresse.
      2. Placez les souris individuelles sur un coussin chauffant dans le cône nasal de l’appareil d’anesthésie, frottez la zone rasée avec de la chlorhexidine. Ensuite, arrosez d’éthanol à 70 % et laissez-le s’évaporer.
      3. Préparez des morceaux ou divisez la suspension tumorale dans une boîte de Pétri en monticules individuels pour l’implantation chirurgicale (c’est-à-dire en trois monticules égaux si elle doit être implantée dans 3 souris).
      4. À l’aide de la lame du scalpel, faites une incision d’environ 5 mm de long au centre du dos de la souris, prenez une paire de pinces et soulevez la peau du côté de l’incision opposé à l’opérateur.
      5. Prenez les ciseaux dans l’autre main et séparez la peau de la couche musculaire en coupant doucement la membrane fasciale avec de petites coupures de ciseaux, créant ainsi une « poche » pour le tissu tumoral.
      6. Prenez un morceau de tumeur ou un monticule individuel de tissu de boue tumorale avec la lame du scalpel et placez doucement le tissu dans la poche créée.
      7. Administrez 100 μL de matrice extracellulaire artificielle sur le monticule de tissu tumoral dans la poche.
      8. À l’aide de deux paires de pinces, tirez l’incision aux deux extrémités de manière à ce que les bords de la plaie se rapprochent, et fermez la plaie en appliquant un ou deux clips de plaie.
      9. Injecter par voie sous-cutanée 1 à 5 mg/kg de méloxicam comme analgésique chez la souris après la chirurgie.
      10. Sortez la souris du cône nasal et remettez-la dans sa cage d’origine ; observez la souris pendant qu’elle se réveille. Ne retournez pas dans une cage avant d’être complètement rétabli.
      11. Retirez les clips de la plaie après environ 7 jours. Si la cicatrisation n’est pas complète après 7 jours, laissez le clip de plaie pendant un ou deux jours supplémentaires.
          note: Si vous utilisez une suspension unicellulaire provenant d’une excision chirurgicale ou d’un traitement tissulaire de biopsie chirurgicale, elle se mélangera à une matrice extracellulaire artificielle (dans un rapport de 1:1) pour l’injection chez la souris.
   2. Injection de tissu de BAF ou de biopsie par forage
      1. Placez une souris NSG sur un support en acier, tenez fermement la souris par la queue et tirez doucement la souris vers l’arrière. Il saisira fermement la grille avec ses pattes avant. Vous pouvez également retenir la souris dans la main non dominante et laisser la zone du flanc visible.
      2. Désinfectez la peau du flanc avec des tampons de préparation à l’alcool. Injectez lentement et régulièrement le contenu de la seringue sous la peau de la souris.
      3. Retirez l’aiguille et remettez la souris dans sa cage.
3. Surveiller la croissance tumorale
   1. Surveillez les souris une fois par semaine pour vérifier les tumeurs palpables.
   2. Une fois que les tumeurs ont une taille mesurable (environ 50 mm³), utilisez un pied à coulisse pour enregistrer les dimensions de la tumeur. Utilisez la formule suivante pour calculer les volumes tumoraux : (largeur x largeur x longueur) / 2.
   3. Récoltez la tumeur une fois que le volume de la tumeur atteint environ 1,5 cm³ (environ 4 à 10 semaines). La tumeur est maintenant appelée passage 1 de la souris (MP1).

Figure 1 : Méthodes d’implantation alternatives.(A) Les tumeurs peuvent être transformées soit en morceaux, soit en suspension de suspension unicellulaire. (B) Les trois méthodes permettront la croissance des tumeurs in vivo. On voit ici des souris implantées par voie sous-cutanée avec une tumeur et imagées 12 jours après l’implantation. (C) Les courbes de croissance tumorale sont présentées pour les souris injectées avec l’une des trois méthodes d’implantation. N = 5 par bras ; Les barres d’erreur sont des erreurs standard.