Méthode de la goutte suspendue : une technique pour générer des sphéroïdes de mélanome en 3D

Résumé

Source : Müller, I. et al., A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model. J. Vis. Exp. (2018)

Cette vidéo décrit la technique de génération de sphéroïdes tridimensionnels via la méthode de la goutte suspendue à l’aide de cellules de mélanome. Le modèle organotypique de mélanome tridimensionnel (3D) généré in vitro peut représenter l’architecture in vivo du mélanome malin et peut donner un aperçu des interactions intra-tumorales.

Protocole

1. Génération de sphéroïdes de mélanome 3D via la méthode de la goutte suspendue

1. Cultivez des cellules de mélanome (p. ex., 451-LU ou toute lignée cellulaire de mélanome d’intérêt) conformément aux protocoles généraux, en utilisant des IPPR contenant 10 % de FCS.
   1. Pour générer des sphéroïdes de mélanome de taille et de qualité similaires, lavez les cellules de mélanome dans du PBS, ajoutez 5 ml de 1x trypsine-EDTA dans du PBS aux cellules dans une fiole de culture cellulaire T175 et incubez pendant 3 à 5 minutes à température ambiante (RT). Neutralisez la trypsine en ajoutant 5 mL de RPMI/10 % de FCS. Récolter les cellules par centrifugation à 200 x g pendant 5 min. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans RPMI/FCS à une concentration finale de 10 000 cellules/mL, déterminée en comptant dans un hémocytomètre.
2. Repérer 40 x 25 μL (= 250 cellules) de la suspension cellulaire sur la surface intérieure du couvercle d’une boîte de culture cellulaire stérile non adhésive (Ø 10 cm) à l’aide d’une multipipette électronique. D’un mouvement rapide mais fluide, tournez le couvercle et placez-le sur la boîte de culture cellulaire respective contenant 5 ml de PBS.
   1. Cultiver dans un incubateur cellulaire à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant 10 à 14 jours, selon le type de cellule utilisé.
      note: Les cellules de la phase de croissance du mélanome métastatique se développent généralement plus rapidement et forment des sphéroïdes plus solides dans la goutte suspendue par rapport aux cellules de mélanome dérivées de la phase de croissance radiale ou de la phase de croissance verticale. Pour une évaluation individuelle, observez la croissance des sphéroïdes à l’aide de jumelles ou d’un microscope optique (grossissement 4X). Habituellement, les sphéroïdes deviennent détectables après 48 h sous une paire de jumelles ou sous un microscope optique (grossissement 4X). Après 10 à 14 jours, ils sont visibles sans aucun appareil de grossissement.
3. Cinq jours après le repérage initial des gouttes, ajouter 10 μL de milieu RPMI/FCS frais à chaque goutte. Par la suite, remplacez 10 μL de fluide tous les deux jours. L’utilisation d’un distributeur électronique est très utile dans cette étape.
4. Selon le type de cellule, récoltez les sphéroïdes après 10 à 15 jours. Rincez soigneusement les sphéroïdes du couvercle de la boîte de culture cellulaire suspendue avec du PBS. Prélever 10 à 20 sphéroïdes dans une boîte de culture cellulaire stérile non adhésive. Retirez soigneusement l’excès de PBS à l’aide d’une pipette Pasteur.
   note: La période de culture dépend de la phase de croissance tumorale des cellules de mélanome lorsqu’elles ont été initialement dérivées, par exemple, les sphéroïdes dérivés de cellules 451-LU atteignent un diamètre d’environ 500 μm dans les 12 jours suivant la culture dans la goutte suspendue.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
albumine sérique fœtale (FCS)	Thermo Fisher Scientific	10270106	Ajouter 10 % au milieu de culture cellulaire
Trypsine-EDTA	Thermo Fisher Scientific	25300054	1X dilué dans PBS
RPMI	Thermo Fisher Scientific	61870010	Pour la culture de lignées cellulaires de mélanome