Génération de reconstructions organotypiques de la peau complète : une procédure pour établir un modèle de peau 3D à l’aide d’échantillons de peau humaine

Résumé

Source : Müller, I. et al. Un modèle de peau sphéroïde de mélanome organotypique en 3D. J. Vis. Exp. (2018)

Cette vidéo décrit le protocole détaillé de génération de reconstructions cutanées organotypiques 3D in vitro pour étudier la progression du mélanome. Ce modèle de peau imite à la fois l’architecture et la complexité multicellulaire des organes in vivo.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des participants humains ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles, nationales et internationales en matière de bien-être humain et ont été examinées par le comité d’examen institutionnel local.

1. Isolement des kératinocytes primaires de l’épiderme

1. Lavez le tissu épidermique avec du PBS. Coupez l’épiderme en petits morceaux (1^mm2) et recueillez-les dans un tube conique de 50 ml. Ajouter 10 ml de 1x trypsine-EDTA (préchauffé à 37 °C) et incuber pendant 5 min dans un bain-marie à 37 °C. Vortex la suspension tissulaire toutes les 2 min.
2. Arrêtez la réaction enzymatique en ajoutant 1 mL de sérum de veau fœtal (SCF). Remettez les cellules en suspension en les pipetant de haut en bas à l’aide d’une pipette en plastique de 10 ml pendant 4 min. Essayez d’éviter la formation de bulles et de mousse.
3. Pipetez la suspension cellulaire dans une crépine cellulaire (taille des pores de 100 μm), placée sur un tube conique frais de 50 ml, et rincez 3 fois avec 5 ml de PBS. Centrifuger les cellules à 200 x g pendant 5 min. Remettre la pastille cellulaire en suspension dans un milieu de culture de 2 à 6 mL contenant 1 % (v/v) de gentamycine. Déterminez le nombre de cellules manuellement en comptant les cellules dans un hémocytomètre et ensemencez 6 x 10⁵ cellules dans une fiole de culture cellulaire T75.

2. Isolement des fibroblastes primaires du derme

1. Coupez le tissu dermique en petits morceaux (1^mm2) et transférez-les dans un tube conique de 50 ml. Ajouter 10 mL de solution de collagénase (5 U/mL dans PBS⁺) et incuber pendant 45 min dans un bain-marie à 37 °C. Centrifuger le mélange de morceaux de tissu et de cellules à 200 x g pendant 5 min.
2. Lavez la pastille cellulaire deux fois avec 10 ml de DMEM contenant 4,5 g/L de glucose et de L-glutamine, mais sans L-Pyruvate. Enfin, remettre les morceaux de tissu en suspension dans 2 mL de DMEM contenant 1 % (v/v) de gentamycine et 10 % de FCS. Transférez-les dans un flacon de culture cellulaire T25 et incubez-les dans un incubateur cellulaire à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant la nuit.
   REMARQUE : Le petit volume permet aux fibroblastes de migrer hors des débris tissulaires et les force à se fixer au ballon de culture.
3. Le lendemain matin, ajoutez 6 mL de DMEM/Gentamycine/FCS et incubez pendant 2 à 3 jours à 37 °C jusqu’à ce que les cellules aient atteint 80-90 % de confluence.

3. Génération du compartiment dermique des reconstructions organotypiques de la peau complète

1. Générez des modèles de peau à l’aide d’inserts de membrane microporeuse à cellules à 24 puits (taille des pores de 8 μm) placés dans des plaques à 24 puits.
   note: Assurez-vous de ne pas utiliser d’inserts suspendus mais debout, car ils seront placés dans une plaque à 6 puits pour une culture air-liquide à un stade ultérieur.
2. Préparez la solution de neutralisation du gel (GNL), ainsi que le milieu de culture appelé MM et le milieu de croissance endothéliale (EGM). Pour prévenir la coagulation, conservez le collagène de type I (généralement de la queue de rat, 3,5-4 mg/mL dans de l’acide acétique 0,02 N) sur de la glace jusqu’à utilisation, car il commence à gélifier à la RT.
3. Remettre en suspension 1 x 10⁵ fibroblastes par insert dans GNL et mélanger rapidement la suspension cellulaire avec du collagène dans un rapport de 1:3 dans un volume final de 500 μL/insert. Mélangez en pipetant doucement de haut en bas pour éviter la formation de bulles, car celles-ci peuvent nuire à la qualité de la reconstruction de la peau.
4. Laissez les gels dermiques individuels se déposer en les maintenant sans milieu à RT pendant 30 min dans une cagoule stérile. Par la suite, couvrez chaque gel avec du DMEM contenant 4,5 g/L de glucose, 1 % de L-glutamine, 10 % de FCS et sans L-pyruvate, et incubez toute la nuit à 37 °C.

4. Génération du compartiment épidermique des reconstructions organotypiques de la peau complète

1. Le lendemain, retirer le milieu des gels dermiques et les équilibrer avec un milieu EGM (10 % FCS, 1 % PenStrep, 10 mg/mL de gentamicine) pendant 2 h à 37 °C. Retirer le milieu et ensemencer soigneusement 1 x 10⁵ kératinocytes remis en suspension dans 100 μL d’EGM sur le gel dermique.
2. Incuber les reconstructions pendant 1,5 h à 37 °C pour permettre aux kératinocytes d’adhérer au compartiment dermique.
   note: Pendant ce temps d’incubation, les gels commenceront à rétrécir en raison de la contraction induite par les fibroblastes, et ainsi, se détacheront au moins partiellement des parois de l’insert.
3. Couvrez les équivalents cutanés avec environ 800 μL d’EGM et retirez soigneusement le gel résiduel de la paroi de l’insert à l’aide d’une petite pointe de pipette (blanche). Cultivez les équivalents cutanés immergés dans l’EGM pendant 7 jours dans un incubateur cellulaire à 37 °C, 5 % de CO₂, et changez de milieu tous les deux jours.
   note: Pendant ce temps, les équivalents cutanés diminueront considérablement.

5. Culture air-liquide de reconstructions organotypiques de la peau complète

1. Au jour 8, transférez chaque insert dans un puits individuel d’une plaque à 6 puits. N’ajoutez que 1,2 à 1,4 mL de milieu MM dans chaque puits, de sorte que la reconstruction de la peau soit alimentée en milieu par le fond du puits mais ne soit pas recouverte avec le milieu < br /> note: La culture à l’interface air-liquide permet la stratification de la partie épidermique et l’établissement d’une couche cornifiée complète (stratum corneum).
2. Au cours des 10 à 17 prochains jours, changez de support comme indiqué à la section 5.1 tous les deux jours. Pendant cette période, ajoutez des médicaments ou d’autres stimuli au besoin au support. Retirez avec précaution toute la reconstruction cutanée de l’insert de la membrane microporeuse à l’aide d’une pince à épiler incurvée pour une analyse plus approfondie, par exemple une analyse immunohistochimique (figure 1).

Résultats

Figure 1 : La culture de la peau organotypique 3D reconstruit sous l’eau avec le milieu et à l’interface air-liquide. Au jour 0, les kératinocytes primaires sont ensemencés sur le toit du compartiment dermique composé de fibroblastes primaires intégrés dans une matrice de collagène de type I. La peau 3D se reconstruit et reste cultivée immergée avec de l’EGM pendant 7 jours, se détache de la p...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
albumine sérique fœtale (FCS)	Thermo Fisher Scientific	10270106	Ajouter 10 % au milieu de culture cellulaire
Trypsine-EDTA	Thermo Fisher Scientific	25300054	1X dilué dans PBS
DMEM	Thermo Fisher Scientific	41965062	pour la culture de fibroblastes primaires
Dispase	Technologies Gibco life	17105041	2U/ml, dissoudre dans du PBS
Collagène de type I	BD Biosciences	354249	Habituellement, à partir de la queue de rat, la concentration doit être de 3,5 à 4 mg / ml
Inserts à 24 puits Nunclon	Nunc	140629	Taille des pores de 8 μm ; utiliser des inserts debout et non suspendus
crépine cellulaire	BD Faucon	Référence 352360	jaune
La gentamycine	Thermo Fisher Scientific	15750060	dissoudre dans PBS
Milieu kératincytaire Keralife	Systèmes cellulaires		ne pas ajouter de SCA ou d’antibiotiques
Collagènase	SERVA	Référence 17454	Nuance standard NB4
kératinocytes humains juvéniles	Systèmes cellulaires	FC-0007	Alternative à la préparation propre à partir du prépuce juvénile
fibroblastes humains juvéniles	Systèmes cellulaires	FC-0001	Alternative à la préparation propre à partir du prépuce juvénile
FEM	Technologies Gibco life	Référence 13247-051	ajouter 10 ng/ml uniquement pour la génération du milieu EGM
Chlorure de calcium	Produits chimiques Merck	Référence 2381	ajouter 1,9 mM pour la génération de l’EGM et 3,8 mM pour le MM moyen
Acide sélénique	Alfa Aesar	18851	ajouter 53 nM pour la génération de médiums EGM et MM
insuline	Lilly	HI0219 Hum Pen 3ml 100 E.I./ml	ajouter 5 μg/ml pour la génération de milieu EGM et MM
éthanolamine	Sigma-Aldrich	E-0135	ajouter 0,1 mM pour la génération de médium EGM et MM
P-éthanolamine	Sigma-Aldrich	P-0503	ajouter 0,1 mM pour la génération de médium EGM et MM
Holo-Transferrine	Sigma-Aldrich	Réf. T-0665	ajouter 5 μg/ml pour la génération de milieu EGM et MM
triiodothyronine	Sigma-Aldrich	Réf. T-6397	ajouter 20 pM pour la génération de EGM et MM medium
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	N° H-088816	ajouter 0,4 μg/ml pour la génération de milieux EGM et MM
progestérone	Sigma-Aldrich	P-8783	ajouter 10 nM uniquement pour la génération du milieu EGM
Hepes	Sigma-Aldrich	N° H-3784	ajouter 15 mM pour la génération de médium EGM et MM
sérine	Sigma-Aldrich	S-4311	ajouter 1 mM pour la génération de médium EGM et MM
Chlorure de choline	Sigma-Aldrich	C-7017	ajouter 0,64 mM pour la génération de l’EGM et du milieu MM
dFCS	Sigma-Aldrich	F-0392 Lot 086K0361	ajouter 2 % pour la génération de fluides EGM et MM
adénine	Sigma-Aldrich	A-9795	ajouter 0,18 mM pour la génération de fluides EGM et MM
L-Glutamine	PromoCell	Réf. C-42209	ajouter 7,25 mM pour la génération de EGM et MM medium
Chlorure de strontium	Sigma-Aldrich	255521	ajouter 1 mM pour la génération de médium EGM et MM