$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparation des cellules B16-BL6
- Retirez les plaques de culture cellulaire de l’incubateur à 37 degrés et placez-les dans une hotte stérile. Les plaques doivent être confluentes à environ 70 % avec des cellules de mélanome murin B16-BL6. Une plus grande confluence peut modifier le potentiel métastatique des cellules.
- Ajouter 1 mL de trypsine-EDTA à 0,05 % par plaque, laisser reposer pendant 1 min, puis aspirer la solution de trypsine-milieu.
- Ajouter 1 mL de trypsine par assiette et remettre les plaques dans l’incubateur pendant 10 min.
- Après avoir déplacé les plaques de l’incubateur vers le capuchon stérile, ajoutez 4 ml de milieu sans sérum du Rosewell Park Memorial Institute (RPMI) à chaque plaque.
- Prélevez les cellules à l’aide d’une pipette motorisée stérile. Éjectez les cellules contre le bas de la plaque, avec la pointe enfoncée à un très léger angle, pour briser les cellules. Répétez l’opération plusieurs fois pour assurer une séparation adéquate des amas de cellules, qui pourraient autrement obstruer l’aiguille d’éjection. Recueillir et transférer dans un tube conique de 50 ml.
- Utilisez un hémocytomètre pour déterminer la densité cellulaire. En gardant le nombre total de cellules B16-BL6 constant, déterminez le volume de RPMI sans sérum nécessaire pour atteindre des concentrations finales de 0, 0,065, 0,015, 0,25 et 0,5 million de cellules/ml.
- Aliquote également le milieu dans le tube de 50 mL ou dans les tubes coniques de 15 mL. Centrifuger les tubes coniques à 2 250 x g pendant 5 min. Décanter les médias. Ajoutez un volume approprié de RPMI sans sérum et confirmez la densité cellulaire souhaitée à l’aide d’un hémocytomètre. Ajustez les densités en ajoutant des RPMI supplémentaires ou en tournant et en remettant en suspension dans un volume plus petit en conséquence.
- Aliquote 500 μL de chaque suspension cellulaire dans des tubes de 1,8 mL étiquetés sur de la glace.
2. Injection de la veine caudale
- Achetez des souris femelles C57BL/6 (âgées de 6 à 8 semaines), 5 souris par groupe. Attendez plusieurs jours pour que les souris s’adaptent.
- Prenez une souris, tenue par la queue, et guidez-la vers l’arrière dans la retenue de souris. Avec le torse dans la chambre principale de la contention et la queue à l’extérieur, tirez la souris vers l’extrémité de la contention. Insérez le piston de retenue en continuant à pousser jusqu’à ce que la souris soit bien fixée.
- Faites pivoter la souris de 90 degrés de sorte que l’une des veines latérales de la queue soit tournée vers le haut. À l'aide d'un tampon imbibé d'alcool, nettoyez vigoureusement le côté de la queue de la souris, en particulier là où la veine de la queue est la plus visible.
note: Un bon éclairage est essentiel pour une visualisation efficace des veines de la queue sur les souris B57BL/6J. Les lampes chauffantes ou les coussinets chirurgicaux chauffants, bien que non nécessaires, aideront également en augmentant le volume de la veine de la queue.
- Dans une hotte de culture stérile, prélever 300 μL de milieu de culture cellulaire dans le tube de 2 millions de cellules/ml. Inversez l’aiguille, en donnant un coup sur le côté et en poussant le piston, pour éjecter les bulles de la seringue. Éjecter la culture-RPMI pour obtenir un volume final de 250 μL.
- Étendez la queue de la souris avec la main non dominante. Tenez la queue avec l’extrémité proximale de la queue levée avec l’index de la main non dominante et la partie distale de la queue enfoncée avec le pouce.
note: De cette façon, la veine de la queue est maintenue en position latérale, parallèlement à la surface de retenue, avec une entrée congruente possible dans la partie la plus distale de la queue.
- Insérez l’aiguille dans la veine de la queue, vers l’extrémité distale, à un angle d’une minute vers le bas pour commencer, puis ajustez l’aiguille pour qu’elle corresponde à l’angle de la veine de la queue lors d’une insertion ultérieure (abaissement de l’extrémité du piston de la seringue par rapport à l’aiguille).
- Insérez l’aiguille à environ 1 cm dans la veine de la queue. Après l’insertion, commencez à pousser le piston en tenant l’aiguille stable.
note: Si l’aiguille se trouve dans la veine de la queue et que l’extrémité de l’aiguille n’est pas obstruée, le média doit s’écouler sans entrave dans la veine. Une injection efficace se caractérise par une clairance sanguine de la veine. S’il y a une résistance ou si une bulle commence à se former au site d’injection, retirez l’aiguille et essayez à nouveau à un endroit plus proximal le long de la veine de la queue.
- Retirez l’aiguille de la veine et jetez-la. Tenez la gaze contre le site d’entrée pour arrêter tout saignement.
- Retirez le piston de la retenue et placez la souris dans la cage réceptrice.
- Répéter l’opération pour toutes les autres concentrations.
note: L’établissement des foyers pulmonaires prend environ 2 à 3 semaines, avec une variabilité en fonction de la lignée cellulaire et de la taille souhaitée des foyers. Dans l’intervalle, les souris doivent être surveillées pour détecter des symptômes qui pourraient justifier une euthanasie précoce, comme un halètement excessif.
3. Compter les foyers pulmonaires
- Euthanasiez la souris en la plaçant dans une chambre de CO2 et en l’exposant à 100 % de CO2 introduit à 10-30 % du volume de la chambre par minute pendant 5 min. Poursuivez avec la luxation cervicale.
- Étalez la souris sur du polystyrène. À l’aide de ciseaux chirurgicaux, créez une incision chirurgicale le long du sternum.
- Faites deux incisions supplémentaires, à la fois à partir du haut de l’incision du sternum et en se ramifiant vers les épaules de la souris, exposant la cage thoracique.
- Faites deux coupes, chacune le long des côtés latéraux du sternum, pour retirer la cage thoracique du torse, exposant les poumons et le cœur.
- En tenant le cœur avec une pince à épiler chirurgicale, coupez l’œsophage et la trachée, libérant ainsi le cœur et les poumons de la souris. Placer sous un microscope à dissection, à un grossissement de 10X, pour une meilleure visualisation.
- Disséquez le cœur des poumons et retirez le thymus, ne laissant que les deux poumons.
- Avec les poumons sous une lunette de dissection, commencez à compter les foyers pulmonaires. Chaque foyer doit apparaître comme une obstruction circulaire et brune à la surface des poumons.
- Pour assurer la cohérence entre les souris, comptez le nombre de foyers à la surface d’un lobe, puis inversez ce lobe. Faire chacun des quatre lobes individuellement permet de compter plus facilement.
- Conservez et fixez les poumons si vous effectuez une IHC, sinon, jetez les restes.