HCR-DNA FISH : une technique d’hybridation in situ en fluorescence pour détecter l’ADN viral dans les cellules infectées

Résumé

Source : Wei Liu et al., Infection et détection du polyomavirus à cellules de Merkel, J. Vis. Exp. (2019).

Dans cette vidéo, les cellules infectées par des virions MCPyV ont été soumises à une réaction en chaîne d’hybridation in situ pour détecter des génomes spécifiques de MCPyV. De plus, la technique DNA-HCR a été combinée à FISH pour visualiser l’ADN MCPyV dans les cellules de peau humaine infectées.

Protocole

1. Infection

1. Maintenez les fibroblastes dermiques humains primaires dans le DMEM avec 10 % de sérum de veau fœtal, 1 % d’acides aminés non essentiels et 1 % de L-glutamine. En atteignant la confluence, divisez les fibroblastes 1:4 sans tourner vers le bas.
   note: Pour obtenir l’efficacité maximale de l’infection par le MCPyV, utilisez des fibroblastes primaires entre les passages 5 et 12 qui se divisent activement au moment de l’ensemencement.
2. Pour infecter les fibroblastes dermiques humains, aspirez le milieu et lavez les cellules avec du DPBS.
3. Ajouter 1 mL de trypsine-EDTA à 0,05 % dans le plat et incuber à 37 °C pendant 5 à 10 min.
4. Vérifiez au microscope pour vous assurer que les cellules se détachent de la parabole.
5. Ajoutez 10 mL de milieu DMEM/F12 contenant 20 ng/mL d’EGF, 20 ng/mL de bFGF et 3 μM de CHIR99021, qui stimulent tous l’infection par MCPyV, dans la boîte et transférez la solution cellulaire dans un tube de 15 mL.
6. Faites tourner les cellules à 180 x g pendant 2 min et jetez le surnageant. Remettre les cellules en suspension dans un milieu DMEM/F12 contenant 20 ng/mL d’EGF, 20 ng/mL de bFGF et 3μM CHIR99021 à raison de 2-4 x 10⁴ cellules par mL.
7. Semez 200 μL de suspension cellulaire complétée par 1 mg/mL de collagénase de type IV dans chaque puits d’une plaque à 96 puits. Décongeler le stock de virions MCPyV sur de la glace. Ajouter 10^{à 9} équivalents du génome viral des virions MCPyV pour 1 μL d’iodixanol pour chaque tranche de 2 500 à 5 000 cellules à infecter. Tapotez doucement le côté de la plaque et placez la plaque dans l’incubateur.
8. Après l’incubation à 37 °C dans 5 % de CO₂ pendant 48 à 72 h, ajouter 20 % de FBS dans chaque puits.
9. Laisser l’infection se poursuivre à 37 °C dans 5 % de CO₂ pendant 72-96 h.

2. ADN in situ-HCR

1. Fixer les cellules cultivées sur des lamelles avec 4 % de PFA dans du PBS pendant 10 min. Laver les lamelles deux fois avec du PBS, puis les traiter avec de l’éthanol à 70 % pour perméabiliser les cellules à 4 °C pendant la nuit.
   note: Les échantillons fixes peuvent rester dans cet état pendant plusieurs jours.
2. Pré-hybrider les échantillons en remplaçant l’éthanol par un tampon d’hybridation de sonde et en incubant pendant 60 min à RT.
3. Diluer la ou les sondes (1 μM) (tableau 1) dans une solution tampon d’hybridation de sonde à 1:500 dilution 30 min avant la fin de l’étape de pré-hybridation et incuber à 45 °C.
4. À la fin des incubations, pipeter ~10 μL de la sonde diluée mélange par lamelle sur les lames de microscope. Placez les lamelles, côté cellulaire vers le bas, sur leurs gouttelettes respectives du mélange de sonde d’hybridation. Scellez les bords et le dos des lamelles sur les lames avec une quantité généreuse de ciment en caoutchouc.
5. Chauffez les lames à l’aide de sondes ajoutées à 94 °C pendant 3 minutes en plaçant les lames sur le côté plat d’un bloc chauffant. Transférez les lames dans une chambre humidifiée et incubez à 45 °C pendant la nuit. Pour réaliser une chambre humidifiée simple, humidifiez légèrement les serviettes en papier stériles avec du dH₂O et placez-les au fond d’un récipient en plastique qui se ferme avec un joint en caoutchouc.
   note: Pendant le chauffage, le ciment en caoutchouc peut bouillonner brièvement. Cependant, assurez-vous que le sceau ne se brise pas.
6. Retirez soigneusement le ciment en caoutchouc à l’aide d’une pince et remettez les lamelles côté cellule vers le haut dans les puits d’une plaque à 24 puits. Lavez trois fois les lamelles avec le tampon de lavage de la sonde à RT.
7. Incuber la lamelle dans le tampon d’amplification (200 μL dans des plaques à 24 puits) à RT pendant 30 à 60 min.
8. Pendant ce temps, recuire chacune des deux épingles à cheveux oligonucléotidiques marquées en reconnaissant les sondes (Tableau 1) dans des tubes PCR séparés en chauffant à 94 °C pendant 90 s et en refroidissant à RT pendant 30 min tout en protégeant de la lumière. Mélangez les deux épingles à cheveux dans un tampon d’amplification, chacune à une dilution de 1:50.
9. Faites une surface pour la réaction d’amplification en étirant un film de paraffine sur la face ouverte d’un couvercle à plaque à 24 puits. Pipeter des gouttelettes de 50 à 100 μL du mélange épingle à cheveux/tampon d’amplification sur le film de paraffine pour chaque lamelle. À l’aide d’une pince, retirez soigneusement les lamelles de la solution de préamplification. Séchez la lamelle en touchant le bord à une lingette jetable poreuse et placez-la côté cellulaire vers le bas sur la gouttelette d’amplification.
10. Placez le couvercle de la plaque contenant les lamelles dans une chambre humidifiée et incubez toute la nuit à RT dans l’obscurité.
11. Remettez les lamelles dans les puits une fois de plus. Incuber les échantillons avec 5x SSCT [5x chlorure de sodium citrate de sodium (SSC) 0,1 % Tween 20 filtré à travers un filtre de 0,22 μm] contenant 0,5 μg/mL de DAPI pendant 1 h à RT. Laver les échantillons deux fois avec 5x SSCT à RT.
12. Montez les lamelles sur des lames de microscope. Analysez les cellules et imagez les échantillons à l’aide d’un microscope à fluorescence inversée.

Sonde MCPyV 1	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA tgagctacctcactaaggagtggtttttatactgcagtttccccccttg ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTCAACTCTCAC
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Sonde MCPyV 8	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA aagcctgggacgctgagaaggacccatacccagaggagagctctggctg ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTCAACTCTCAC
Sonde MCPyV 9	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA agcttcgggaccccccaaattcgcttttgagaatggaggaggggtc ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCCTCCAACTCTCAC
Sonde MCPyV 10	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA cttttggctagaacagtgtctgcggcttgttggcaaatggttttctgaga ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
Sonde HPV 1	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA cagctctgtgcataactgtgttaactttgtcgcctgtgtgtt ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCCTCCAACTCTCAC
Sonde HPV 2	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA acaatattgtaatgggctctgtccggttctgcttgtgtccagctggaccatc ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCCTCCAACTCTCAC
Sonde HPV 3	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA gtcagctatactgggtgtaagtccaaatgcagcaatacaccaatcgcaac ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCCTCCAACTCTCAC
Sonde HPV 4	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA ctttggtatgggtcgcggcggggggtggggccaagtgctgcctaataatt ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCCTCCAACTCTCAC
Sonde HPV 5	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA ccatccattacatcccgtaccctctctccccattggtacctgcaggatcag ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTCCAACTCTCAC

Tableau 1 : Sondes utilisées dans l’étude.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tampon d’hybridation de sonde	Technologies moléculaires
Tampon de lavage de sonde	Technologies moléculaires
Tampon d’amplification	Technologies moléculaires
épingles à cheveux étiquetées Alexa 594	Technologies moléculaires	B4	Protéger de la lumière
Paraformaldéhyde	Sigma	P6148