Toutes les procédures impliquant des participants humains ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles, nationales et internationales en matière de bien-être humain et ont été examinées par le comité d’examen institutionnel local.
1. Isolement des kératinocytes de la peau humaine
- Commencez par préparer les solutions suivantes : une solution de 50 ml de trypsine à 0,25 % et de glucose à 0,1 % dans du DPBS. Mélanger et filtrer pour stériliser (0,2 μm) la solution. Préparez 10 mL de solution RPMI-1640 + 2 % FBS, 50 mL de DPBS et un milieu sans sérum de kératinocytes (KSFM). Ajouter des suppléments de KSFM et 250 μL de gentamycine à 500 mL de KSFM. Préchauffez les solutions à 37 °C avant utilisation.
- Prélever de la peau sur des volontaires adultes en bonne santé subissant une chirurgie plastique. Les échantillons de peau utilisés mesurent environ 10 cm x 15 cm, mais leur taille peut varier. Gardez la peau au frais pendant le transport en transportant les échantillons de peau dans une boîte en polystyrène contenant un élément de refroidissement. Si nécessaire, l’échantillon de peau peut être stocké à 4 °C pendant la nuit.
- Enlevez la graisse sous la section de la peau à l’aide de ciseaux, de scalpels et de pinces stérilisés.
- Bouclez la partie de la peau (environ 10 cm x 15 cm) sur un couvercle stérile sur une assiette à l’aide d’aiguilles. Tout d’abord, nettoyez la peau avec un tampon de gaze sèche et stérilisée. Ensuite, nettoyez la peau à l’aide d’un tampon de gaze stérilisé avec de l’éthanol à 70 %.
- À l’aide d’une raboteuse à pieds, coupez la couche supérieure (épiderme) de la section de la peau et mettez-la dans une boîte de Pétri de 9 cm. Ensuite, ajoutez immédiatement 25 ml de la solution DPBS/trypsine/glucose (préparée à l’étape 1.1) dans la boîte de Pétri. Incuber pendant 30 min à 37 °C.
- À l’aide d’une pipette, retirer la solution DPBS/trypsine/glucose de la boîte de Pétri et ajouter 10 ml de RPMI-1640 + 2 % de FBS pour inactiver la trypsine.
- À l’aide de deux pinces, libérez maintenant les cellules de l’épiderme dans le milieu en grattant et en agitant doucement l’épiderme et le compartiment dermique des sections de peau.
- Filtrer la suspension de cellules épidermiques à travers un filtre métallique (trou de 1 mm) et recueillir dans un tube de 50 ml. Ajouter les sections de peau restantes dans un tube de 50 mL contenant 10 mL de RPMI-1640 sans FBS et vortex pendant 10 s. Filtrez la suspension à travers le filtre métallique dans un tube de 50 mL contenant la suspension de cellules épidermiques. Ajouter le DPBS à un volume total de 50 ml.
- Centrifuger la suspension cellulaire pendant 10 min à 450 x g à température ambiante.
- Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille de cellules épidermiques dans environ 10 mL de KSFM à 37 °C, selon la taille de la pastille cellulaire. Comptez les cellules à l’aide de la méthode de coloration au bleu trypan au microscope. Le nombre de cellules obtenues à partir d’une section de peau de 10 cm x 15 cm est d’environ 50-100 x 106 cellules. Dans chaque flacon deculture de 75 cm 2, transférez 8 x 106 cellules avec 12 mL de KSFM à 37 °C. Agitez doucement les flacons de culture pour assurer une répartition uniforme des cellules.
- Incuber les kératinocytes dans un incubateur à 37 °C avec 100 % d’humidité et 5 % de CO2. Changez de milieu après 2 jours et trois fois par semaine. Passage des cellules lorsque la culture est confluente à 70-80 %, ce qui prend environ 2 semaines en fonction du taux de prolifération des kératinocytes.
