Isolement de cellules souches de mélanome : une méthode pour obtenir des cellules de mélanome CD133 positives et négatives à l’aide du tri cellulaire activé par magnétisme

Résumé

Source : Welte, Y. et al. Culture cellulaire dérivée d’un patient et isolement de cellules souches cancéreuses présumées CD133+ à partir d’un mélanome. J. Vis. Exp. (2013)

Cette vidéo décrit la technique d’isolement des cellules souches de mélanome CD133 négatives et positives à partir d’une lignée cellulaire de mélanome primaire à l’aide du tri cellulaire activé magnétiquement. Les CSC de mélanome CD133 positifs sont étudiés plus en détail pour comprendre les mécanismes de la tumorigenèse du mélanome.

Protocole

1. Tri magnétique des cellules de mélanome CD133⁺ et CD133^- à l’aide de colonnes LS

1. Préparez un tampon MACS contenant 2 mM d’EDTA et 5 % de FCS dans PBS. Mélanger par inversion et tampon de filtrat stérile à l’aide d’une unité de filtration Steritop-GP de 0,22 μm. Réfrigérer le tampon à 4-8 °C et dégazer avant utilisation.
2. Préchauffez l’Accutase, le PBS et le Quantum 263 à 37 °C.
3. Laver 80 % des cellules confluentes avec du PBS. Ajoutez une quantité appropriée d’Accutase et incubez jusqu’à ce que les cellules se détachent de la surface de la culture. Prélever les cellules dans un tube de 50 mL à l’aide du milieu Quantum 263.
4. Déterminez le numéro de cellule et centrifugez le nombre requis de cellules pendant 5 min à 300 x g et 4-8 °C. (Selon le protocole de Miltenyi, un maximum de 2x 10⁹ cellules peut être chargé par colonne LS. Les nombres optimaux spécifiques à la lignée cellulaire doivent être déterminés et peuvent être considérablement inférieurs.) Aspirer complètement le surnageant.
5. Remettez en suspension un maximum de 1 x 10⁸ cellules avec un tampon MACS de 350 μL (pour un nombre de cellules plus élevé, augmentez tous les volumes suivants de tampon MACS, de réactif bloquant FcR, de CD133/1-Biotine et de microbilles anti-biotine en conséquence).
6. Ajouter 100 μL de réactif bloquant FcR.
7. Ajouter 50 μL de CD133/1-Biotine. Bien mélanger à l’aide d’un vortex et incuber à 4-8 °C pendant 10 min.
8. Laver les cellules en ajoutant 10 mL de tampon MACS et centrifuger pendant 5 min à 300 x g et 4-8 °C. Aspirer complètement le surnageant.
9. Répétez l’étape de lavage (1.8).
10. Remettre en suspension la pastille de cellule avec un tampon MACS de 400 μL.
11. Ajouter 100 μL de microbilles anti-biotine. Bien mélanger à l’aide d’un vortex et incuber à 4-8 °C pendant 15 min.
12. Pendant ce temps, préparez le séparateur MACS pour la séparation magnétique. Fixez QuadroMACS au séparateur MACS Multi Stand. Insérez le nombre requis de colonnes LS avec les ailes de colonne vers l’avant dans le champ magnétique du QuadroMACS. Placez un filtre de pré-séparation (avec un treillis en nylon de 30 μm) dans chaque colonne LS et un tube de collecte approprié (15 ml ou 50 ml) sous chaque colonne. Préparez le filtre et la colonne en les rinçant avec un tampon MACS de 3 ml. Jeter le flux continu.
13. Laver les cellules en ajoutant 10 mL de tampon MACS et centrifuger pendant 5 min à 300 x g et 4-8 °C. Aspirer complètement le surnageant.
14. Remettez les cellules en suspension avec un tampon MACS de 500 μL et appliquez la suspension de cellule sur la colonne LS avec le filtre de pré-séparation.
15. Laver trois fois avec 3 ml de tampon MACS par colonne. N’ajoutez le tampon frais que lorsque le réservoir de la colonne est vide.
16. La totalité de l’effluent collecté contient la fraction de cellule CD133^- non étiquetée.
17. Jetez le filtre de pré-séparation, retirez la colonne du séparateur et placez-la sur un tube de collecte approprié.
18. Appliquez une mémoire tampon MACS de 5 ml. Rincez immédiatement les cellules CD133⁺ marquées en poussant fermement le piston dans la colonne.
19. Pour augmenter la pureté de la fraction négative, appliquez une suspension cellulaire sur une nouvelle colonne LS équilibrée insérée dans le QuadroMACS. L’effluent contient la fraction CD133^-.
20. Supprimez les colonnes.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Accutase	Laboratoires PAA GmbH	N° L11-007
Sel disodique de l’acide éthylènediaminetétraacétique déshydraté (EDTA)	Sigma-Aldrich, Inc.	E-7889
CD133/1 (W6B3C1)	Miltenyi Biotec GmbH	Tél. : 130-092-395
Kit Micro-billes CD133 indirectes humaines	Miltenyi Biotec GmbH	Tél. : 130-091-895	Comprend : CD133/1(AC133)-Biotine, microbilles anti-biotine et réactif bloquant FcR
Quantique 263	Laboratoires PAA GmbH	U15-815
Séparateur MACS Multi Stand	Miltenyi Biotec GmbH	Tél. : 130-042-303
Colonnes de séparation MACS 25 colonnes LS	Miltenyi Biotec GmbH	Tél. : 130-042-401
Séparateur QuadroMACS	Miltenyi Biotec GmbH	Tél. : 130-090-976