Toutes les procédures impliquant des animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Isolement des mélanocytes et des fibroblastes
- Euthanasier des petits C57Bl/6J mâles et/ou femelles âgés de 0 à 4 jours par décapitation, et retirer les extrémités des souris euthanasiées à l’aide de ciseaux chirurgicaux.
- Dans une armoire à flux laminaire, roulez brièvement le tronc de chaque souris dans une boîte de Pétri stérile contenant 70 % d’éthanol. Retirez le tronc de l’éthanol et placez-le dans une boîte de Pétri vide et stérile.
- À l’aide de ciseaux chirurgicaux, stérilisés à 70 % d’éthanol, faites une incision dans la peau sur la face ventrale du tronc en commençant par le cou jusqu’à la queue. Pelez la peau du tronc de la souris à l’aide d’une pince stérile.
- Placez la peau, côté derme vers le bas, dans un plat à 6 puits contenant 3 ml de 1 solution d’antibiotique/antimycosique et incubez à température ambiante pendant 2-3 min.
- Allumez le hachoir à tissus avec les paramètres suivants en place : Épaisseur de la tranche : 1 μm ; Force de la lame : ~60 % du maximum ; Vitesse : ~50 % du maximum.
- Transférez la peau, côté derme vers le bas, dans un disque de hachoir à tissus stériles et passez complètement la peau à travers le hachoir à tissus activé 3 fois.
- Transvaser la peau homogénéisée dans un tube conique stérile de 15 mL contenant 3 mL de tampon de digestion cutanée (préparer 3 mL de tampon de digestion cutanée fraîche contenant 10 % de sérum de veau fœtal, 1 % de solution de pénicilline/streptomycine, 1 % de L-glutamine, 10 mg/mL de collagénase de type I, 0,25 % de trypsine porcine et 0,02 mg/mL de désoxyribonucléase I dans RPMI 1640). Mélangez la suspension obtenue en pipetant 10 à 15 fois vers le haut et vers le bas avec une micropipette P1000.
- Boucher le tube conique et incuber l’échantillon dans un bain-marie à 37 °C pendant 15 min, en inversant le tube toutes les 3 à 5 min.
- Granulez les cellules de la peau et homogénez en centrifugeant le tube conique dans un rotor à godets oscillants à 750 x g pendant 5 min à température ambiante.
- À l’aide d’une micropipette P1000, retirez lentement et complètement le tampon de digestion cutanée en faisant attention de ne pas déranger la pastille.
note: Une partie de la peau entière peut être conservée à ce stade et utilisée comme contrôle pour confirmer la pureté cellulaire. Filtrez ces cellules à travers une crépine de cellules de 70 μm et poursuivez le processus.
- Remettez complètement la pastille cellulaire en suspension dans 1 mL de milieu mélanocytaire en pipetant de haut en bas 15 à 20 fois avec une micropipette P1000. Ajouter la solution cellulaire résultante goutte à goutte dans un puits non enrobé d’une boîte à 6 puits contenant 1 mL de milieu mélanocytaire.
- Placez l’homogénat de peau plaqué dans un incubateur de culture tissulaire réglé à 37 °C et 5 % CO2. Laissez les cultures incuber pendant 40 min.
note: Pendant ce temps, certains fibroblastes de l’homogénat de la peau adhéreront à la boîte non enrobée tandis que les mélanocytes et les kératinocytes resteront en suspension.
- Transférez le surnageant de culture de la boîte non enrobée dans un puits d’une boîte à 6 puits prélavée et enrobée de collagène. Ajouter le G418 au milieu de manière à ce que la concentration finale soit de 100 ng/mL.
- Ajoutez 2 ml de média de fibroblaste dans un puits de la boîte non enrobée, contenant maintenant des fibroblastes adhérents.
- Incuber les deux cultures pendant la nuit dans un incubateur de culture tissulaire réglé à 37 °C et 5 % CO2.
- Aspirez séparément le milieu et tous les débris de chaque culture, 16 à 24 h après le placage. Lavez chaque plat deux fois avec 1 mL de PBS stérile, puis ajoutez 2 mL de milieu de mélanocytes frais plus 100 ng/mL de G418 à la culture de mélanocytes et 2 mL de milieu de fibroblastes frais à la culture de fibroblastes. (Préparez 6 ml de milieu de mélanocyte frais contenant 10 % de sérum de veau fœtal, 7 % de sérum de cheval, une solution de pénicilline/streptomycine à 1 %, 1 % de L-glutamine, 0,5 mM de di-butyryl cyclique AMP (dbcAMP), 20 nM de tétradécanoylphorbol-13-acétate (TPA) et 200 pM de toxine cholérique (CT) dans le milieu de Fiber Mix F-12 Ham.
REMARQUE : Les solutions mères concentrées de dbcAMP, TPA et CT peuvent être fabriquées, aliquotes et stockées pendant >1 an à -80 °C. Les milieux de base dépourvus de ces composants peuvent être stockés jusqu’à 1 mois à 4 °C
Préparez 4 ml de milieu fibroblastique contenant 10 % de sérum de veau fœtal, 1 % de pénicilline/streptomycine et 1 % de L-glutamine dans le milieu Eagle modifié de Dulbecco. Ce support peut être stocké à 4 °C jusqu’à 1 mois)
- Après que les cultures de mélanocytes ont été traitées avec G418 pendant 48 h, laver les cellules deux fois avec 1 mL de PBS stérile et ajouter 2 mL de milieu de mélanocytes frais sans G418 à la culture.
note: Alors que les fibroblastes de la culture de mélanocytes continuent de mourir après le traitement G418, lavez la boîte avec du PBS stérile pour éliminer les cellules mortes et ajoutez du milieu de mélanocytes frais. Les cultures de mélanocytes et de fibroblastes doivent être passées lorsqu’elles atteignent 70-80 % de confluence.
