Préparation du virion du polyomavirus à cellules de Merkel recombinante (MCPyV) : une technique pour produire un virion MCPyV recombinant à titre élevé

Résumé

Source : Wei Liu et al. Infection et détection du polyomavirus à cellules de Merkel, J. Vis. Exp. (2019)

Dans cette vidéo, nous montrons la préparation des virions du polyomavirus à cellules de Merkel ou MCPyV à l’aide de cellules 273TT. Cette technologie permet de produire un titre élevé de virions recombinants MCPyV.

Protocole

1. Préparation du virion MCPyV recombinant

1. Digérer 50 μg de plasmide pR17b (portant le génome MCPyV) avec 250 U de BamHI-HF dans un volume de 200 μL (4 h à 37 °C) pour séparer le génome viral du squelette du vecteur (Figure 1).
2. Ajoutez 1200 μL de tampon PB (complété par 10 μL de 3 M NaAc, pH 5,2) à l’ADN digéré et purifiez sur 2 colonnes de spin miniprep (capacité d’ADN de 20 μg). Éluer le plasmide pR17b digéré de chaque colonne avec 200 μL de tampon TE (10 mM de Tris-HCl, pH8.0, 1 mM d’EDTA).
3. Préparez la réaction de ligature dans un tube à centrifuger de 50 ml. Ajouter 400 μL d’ADN plasmidique purifié à l’étape 1.2, 8,6 ml de tampon ligase 1,05x T4 et 6 μL de T4 ligase à haute concentration. Incuber à 16 °C pendant la nuit.
4. Ajoutez 45 ml de tampon PB (complété par 10 μL de 3 M NaAc, pH 5,2) à la ligature et utilisez un collecteur à vide pour charger à travers 2 colonnes de centrifugation miniprep. Éluer chaque colonne avec 50 μL de tampon TE. Attendez-vous à un rendement d’environ 30 μg d’ADN.
5. En fin d’après-midi ou en soirée, ensemencez 6 x 10^{cellules 6} 293TT dans une boîte de 10 cm contenant du milieu DMEM complété par 10 % de sérum de veau fœtal, 1 % d’acides aminés non essentiels et 1 % de L-glutamine sans hygromycine B.
6. Le lendemain matin, assurez-vous que les cellules sont confluentes à environ 50 %. Transfect à l’aide de 66 μL de réactif de transfection (1,1 μL/cm²), de 12 μg d’ADN R17b d’isolat MCPyV religaturé à partir de l’étape 1.4, de 8,4 μg de plasmide d’expression ST pMtB et de 9,6 μg de plasmide d’expression LT pADL.
7. Lorsque les cellules transfectées sont presque confluentes, le lendemain, essayez de les tester et transférez-les dans une boîte de 15 cm pour une expansion continue.
8. En option, prélever un petit nombre de cellules 293TT lors de l’expansion et effectuer une coloration IF pour MCPyV LT (CM2B4) et VP1 (MCV VP1 rabbit) afin de déterminer l’efficacité de la transfection. À ce stade, les signaux nucléaires LT peuvent être visibles, mais l’expression de VP1 ne sera probablement pas détectable.
9. Lorsque la boîte de 15 cm devient presque confluente (généralement 5 à 6 jours après la transfection initiale), transférez les cellules dans trois boîtes de 15 cm. Récoltez les cellules dans les boîtes de 15 cm lorsqu’elles deviennent presque confluentes et suivez le protocole de récolte du virus ci-dessous.
   note: Effectuez éventuellement le contrôle qualité SI comme décrit à l’étape 1.8. La plupart des cellules doivent être à la fois positives pour MCPyV LT et VP1 à ce stade.
10. Pour récolter le virus, trypsinisez les cellules, faites tourner à 180 x g pendant 5 min à RT et retirez le surnageant. Ajouter un volume de pastille cellulaire de DPBS-Mg (DPBS avec 9,5 mM de MgCl₂ et 1x antibiotique-antimycosique). Ensuite, ajoutez 25 mM de sulfate d’ammonium (à partir d’une solution mère de pH 9 à 1 M) suivi de 0,5 % de Triton X-100 (à partir d’une solution mère à 10 %), de 0,1 % de benzonase et de 0,1 % d’une DNase dépendante de l’ATP. Bien mélanger et incuber à 37 °C pendant la nuit.
11. Incuber le mélange pendant 15 min sur de la glace puis ajouter 0,17 volume de 5M de NaCl. Mélanger et incuber sur glace pendant encore 15 min. Essorage pendant 10 min à 12 000 x g dans une centrifugeuse à 4 °C. Si le surnageant n’est pas clair, retournez doucement le tube et répétez l’étape de rotation. Transférez le surnageant dans un nouveau tube.
12. Remettre la pastille en suspension à l’aide d’un volume de DPBS complété par 0,8 M de NaCl, et l’essorer à nouveau, comme décrit à l’étape 1.11.
13. Combinez les surnageants des étapes 1.11 et 1.12 et tournez une fois de plus comme décrit à l’étape 1.11.
14. Verser des gradients d’iodixanol dans des tubes polyallomères à paroi mince de 5 mL par sous-couche (27 %, puis 33 %, puis 39 %) par étapes de ~0,7 mL à l’aide d’une seringue de 3 mL munie d’une longue aiguille ou d’une pipette p1000.
15. Chargez 3 mL de surnageant clarifié contenant un virus sur le gradient d’iodixanol préparé.
16. Rotation pendant 3,5 h à 234 000 x g et 16 °C dans un rotor SW55ti. Réglez l’accélération et la décélération sur ralentir.
17. Après ultracentrifugation, prélever 12 fractions dans des tubes siliconés (chaque fraction est de ~400 μL).
18. Analyser les fractions pour détecter la présence du virus à l’aide d’un réactif d’ADNdb et/ou d’un transfert Western pour VP1 (MCV VP1 lapin). Mettez en commun des fractions de gradient avec une teneur maximale en ADNdb et/ou en VP1 et caractérisez le stock par PCR quantitative pour calculer l’équivalent du génome viral. Conserver le stock de virion MCPyV à -80 °C.

Résultats

Graphique 1. Production du virion MCPyV à l’aide du génome viral recombinant.(A) Une carte plasmidique de pR17b (plasmide du génome MCPyV). (B) Une image représentative d’un échantillon de virion MCPyV récolté et purifié sur un gradient. La flèche marque la bande de virions MCPyV concentrée au cœur du gradient. (C) Le nombre de copies du génom...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
DMEM/F12 moyen	Thermo Fisher Scientific	Référence 11330-032
Protéine EGF humaine recombinante, CF	Systèmes de R&D	236-EG-200	Conserver à -80 degrés Celsius
CHIR99021	Cayman Chemical	Référence 13122	Conserver à -80 degrés Celsius
CHIR99021	sigma	SML1046	Conserver à -80 degrés Celsius
Collagénase de type IV	Thermo Fisher Scientific	17104019
Dispase II	Roche	4942078001
Antibiotique-Antimycosique	Thermo Fisher Scientific	Référence 15240-062	Protéger de la lumière
DMEM moyen	Thermo Fisher Scientific	11965084
paraformaldéhyde	sigma	Réf. P6148
Anti-MCPyV LT (CM2B4)	Santa Cruz	SC-136172	Lot # B2717
MCV VP1 lapin		Sérum polyclonal de lapin #10965	https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm