Préparation du virion du polyomavirus à cellules de Merkel recombinante (MCPyV) : une technique pour produire un virion MCPyV recombinant à titre élevé

Résumé

Source : Wei Liu et al. Infection et détection du polyomavirus à cellules de Merkel, J. Vis. Exp. (2019)

Dans cette vidéo, nous montrons la préparation des virions du polyomavirus à cellules de Merkel ou MCPyV à l’aide de cellules 273TT. Cette technologie permet de produire un titre élevé de virions recombinants MCPyV.

Protocole

1. Préparation du virion MCPyV recombinant

1. Digérer 50 μg de plasmide pR17b (portant le génome MCPyV) avec 250 U de BamHI-HF dans un volume de 200 μL (4 h à 37 °C) pour séparer le génome viral du squelette du vecteur (Figure 1).
2. Ajoutez 1200 μL de tampon PB (complété par 10 μL de 3 M NaAc, pH 5,2) à l’ADN digéré et purifiez sur 2 colonnes de spin miniprep (capacité d’ADN de 20 μg). Éluer le plasmide pR17b digéré de chaque colonne avec 200 μL de tampon TE (10 mM de Tris-HCl, pH8.0, 1 mM d’EDTA).
3. Préparez la réaction de ligature dans un tube à centrifuger de 50 ml. Ajouter 400 μL d’ADN plasmidique purifié ....

Résultats

Graphique 1. Production du virion MCPyV à l’aide du génome viral recombinant.(A) Une carte plasmidique de pR17b (plasmide du génome MCPyV). (B) Une image représentative d’un échantillon de virion MCPyV récolté et purifié sur un gradient. La flèche marque la bande de virions MCPyV concentrée au cœur du gradient. (C) Le nombre de copies du génom.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
DMEM/F12 moyen	Thermo Fisher Scientific	Référence 11330-032
Protéine EGF humaine recombinante, CF	Systèmes de R&D	236-EG-200	Conserver à -80 degrés Celsius
CHIR99021	Cayman Chemical	Référence 13122	Conserver à -80 degrés Celsius
CHIR99021	sigma	SML1046	Conserver à -80 degrés Celsius
Collagénase de type IV	Thermo Fisher Scientific	17104019
Dispase II	Roche	4942078001
Antibiotique-Antimycosique	Thermo Fisher Scientific	Référence 15240-062	Protéger de la lumière
DMEM moyen	Thermo Fisher Scientific	11965084
paraformaldéhyde	sigma	Réf. P6148
Anti-MCPyV LT (CM2B4)	Santa Cruz	SC-136172	Lot # B2717
MCV VP1 lapin		Sérum polyclonal de lapin #10965	https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm