Toutes les procédures impliquant des animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparation du tissu cutané transparent de souris
REMARQUE : Toutes les souris utilisées dans cette étude avaient un fond génétique C57BL/6
- Collecte de tissu cutané de souris.
- Euthanasier sans cruauté les souris par luxation cervicale.
- Retirez soigneusement les poils de la zone cutanée concernée à l’aide d’une tondeuse en prenant soin de ne pas blesser la peau.
- Lavez la peau pour la décontaminer avec de l’éthanol à 70 % dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
- Soulevez la peau dorsale du cou avec des pinces et faites une incision avec des ciseaux.
- Disséquez une grande zone de peau de souris dorsale (environ 1,5 x 4 cm).
- Aplatir la peau, côté dermique vers le bas, sur un papier filtre et noter l’orientation antéro-postérieure de l’échantillon.
- Coupez le papier filtre autour de la peau disséquée et placez-le dans un tube de 15 ml rempli d’une solution de paraformaldéhyde à 4 % (PFA) fraîchement préparée dans du PBS.
- Laisser reposer 1 heure à température ambiante ou toute la nuit au réfrigérateur à 4 °C.
- Laver la peau 2x 5 min dans du PBS dans un tube de 15 mL.
note: Les étapes suivantes (1.1.10 - 1.1.12) sont facultatives pour l’entreposage à long terme des tissus.
- Déshydrater la peau disséquée dans du PBS avec une concentration croissante d’éthanol (25 %, 50 %, 70 %) dans un tube de 15 mL pendant les étapes de lavage de 1 heure à température ambiante.
- Conservez la peau déshydratée dans de l’éthanol à 70 % dans du PBS dans un tube de 15 mL à 4 °C jusqu’à nouvel ordre.
- Quatre heures avant l’éclaircissement, réhydratez le tissu cutané dans du PBS avec une concentration décroissante d’éthanol (70 %, 50 %, 25 %, 0 %) dans un tube de 15 ml pendant les étapes de lavage de 1 heure à température ambiante.
- Nettoyage des biopsies de la peau de souris
- Préparez la solution de clarification CUBIC1 en dissolvant 3,85 g d'urée et 3,85 g de N,N,N',N'-tétrakis (2-hydroxypropyl) éthylènediamine dans 5,38 ml d'eau distillée sur un appareil de chauffage réglé à 60-70 °C. Utilisez un agitateur chaud.
- Ajoutez 2,31 g de polyéthylène glycol mono-p-isooctylphényléther / Triton X-100 à la solution une fois qu’elle est claire et qu’elle a refroidi à température ambiante.
- Coupez la peau de la souris à l’aide d’une lame de rasoir tranchante en biopsies d’environ 0,2 x 0,5 cm, puis immergez-la dans un tube de 15 ml dans 5 ml de solution éclaircissante CUBIC1. Pour optimiser la visualisation des follicules pileux, assurez-vous que le côté le plus long de la biopsie est coupé le long de la direction antéro-postérieure de l’échantillon.
- Placer sur une plate-forme tournante dans un four d’hybridation à 37 °C.
- Changez la solution de clarification après 7 jours. Préparez une solution CUBIC1 fraîche avant utilisation.
- Vérifiez la transparence du tissu après 7 jours. Si nécessaire, laissez les biopsies dans la solution d’élimination CUBIC1 jusqu’à ce que le tissu soit complètement transparent.
- Une fois que la biopsie cutanée est transparente, prélever la solution CUBIC1 et ajouter 4 ml de 1x PBS pour laver le tissu 4 fois pendant 6 heures à 37 °C.
- Laver le tissu cutané avec du saccharose à 20 % p/v dans du PBS dans un tube de 15 ml pendant 4 heures à 37 °C.
- Congelez le tissu dans un produit de montage à température de coupe optimale (OCT) dans un tube de 15 ml pendant la nuit dans un congélateur à -80 °C.
note: Cette étape augmentera la perméabilité de la biopsie pour la pénétration des anticorps dans les étapes suivantes.
2. Coloration par immunofluorescence
- Décongelez le tissu (étape 1.2.9) à température ambiante pendant 2 à 3 heures.
- Lavez le mouchoir dans un tube de 15 ml avec 5 ml de PBS pendant 8 heures à température ambiante pour éliminer le composé OCT.
- Transférez les biopsies dans un tube de 2 mL et incubez du tissu dans 1 mL d’anticorps anti-kératine de lapin14 ou d’anticorps anti-Ki67 de lapin, tous deux dilués à 1:100 dans du PBST (PBS + 0,1 % de Triton-X100) pendant 3 jours sur un agitateur dans un four à 37 °C.
- Transférez les biopsies dans un tube de 15 ml et lavez le tissu 4 fois pendant 6 heures dans 5 ml de PBST sur un shaker dans un four à 37 °C.
- Transférez les biopsies dans un tube de 2 ml, ajoutez 1 ml d’anticorps secondaire anti-lapin Alexa594 dilué 1:100 dans du PBST et incubez 3 jours sur un agitateur dans un four à 37 °C.
- Transférez les biopsies dans un tube de 15 ml et lavez le tissu 4 fois pendant 6 heures dans 5 ml de PBST sur un shaker dans un four à 37 °C.
- Transférez les biopsies dans un tube de 2 mL, ajoutez 1 mL de solution de contre-coloration nucléaire de 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) (1:1 000) dans du PBST et incubez toute la nuit sur un agitateur dans un four à 37 °C.
- Retirer la solution de contrecoloration DAPI et ajouter 1 ml de PBST dans le tube de 2 ml pour laver le mouchoir 4 fois pendant 6 heures sur un agitateur dans un four à 37 °C.
note: Étape facultative : Les biopsies peuvent être stockées dans l’obscurité dans 1x PBS avec 0,02 % d’azoture de sodium pendant au moins 3 semaines.
3. Imagerie
- Préparez la solution de clarification CUBIC2, qui contient 50 % (p/v) de saccharose, 25 % (p/v) d'urée, 10 % (p/v) de 2,2′,2′'-nitrilotriéthanol et 0,1 % (v/v) de Triton X-100.
- Incuber le tissu cutané dans 1 mL de solution CUBIC2 dans un tube de 2 mL sur un agitateur pendant 24 heures dans un four à 37 °C. Cette étape permettra d’égaliser l’indice de réfraction du tissu.
- Vérifiez la clarté du tissu. Une fois que le résultat est clair, placez la biopsie cutanée entière (0,2 x 0,5 cm) sur son côté le plus long sur une lamelle en verre, de sorte que la direction de la longueur des follicules pileux soit parallèle à la surface de la lamelle (#1 24 x 60 mm).
note: Étape facultative : Les biopsies colorées aux anticorps peuvent être conservées dans la solution CUBIC2 pendant environ 7 jours. Les biopsies colorées au rouge du Nil ne peuvent être conservées dans la solution CUBIC2 que pendant 1 jour au maximum et doivent être imagées dès que possible.
- Préparation de la chambre d’imagerie (Figure 1).
REMARQUE : Les consommables nécessaires à la préparation de la chambre d’imagerie sont les suivants : colle bleue, pâte à modeler ou similaire, et 2 lamelles (24 x 50 mm) (Figure 1A).
- Préparez deux fines bandes de colle bleue (diamètre d’environ 1 mm x 2 cm) et deux lamelles (figure 1B).
- Placez des bandes adhésives bleues sur une lamelle de couverture, en laissant suffisamment d’espace pour la biopsie cutanée (figure 1C, étape 3.4.3).
- Placez la biopsie cutanée entre les bandelettes sur la lamelle dans une goutte de solution de CUBIC2 (Figure 1C).
- Couvrir la biopsie cutanée avec la deuxième lamelle (figure 1D).
- Placez la chambre d’imagerie avec la biopsie cutanée montée sur la platine d’un microscope confocal et déplacez le tissu dans la voie lumineuse.
- Numérisez l’échantillon à l’aide d’une source lumineuse au mercure ou halogène et de filtres d’épifluorescence standard (p. ex., DAPI/GFP/CY3/CY5) pour identifier les régions d’intérêt colorées par fluorescence.
- Imagez les régions d’intérêt à l’aide d’un objectif 10X et 20X (NA 0,75) et de techniques d’imagerie confocale par fluorescence standard (par exemple, avec des échantillons colorés DAPI, éclairez avec un laser de 405 nm et collectez le signal de fluorescence entre 425 et 475 nm, et avec Alexa Fluor 594 ou Nile Red, éclairez avec un laser de 561 nm et collectez le signal de fluorescence entre 570 et 620 nm).
- Générez des piles Z d’images de chaque région d’intérêt à l’aide d’un logiciel d’acquisition d’images Z de microscope (par exemple, à l’aide du logiciel d’imagerie NIS elements 4.13 comme décrit ci-dessous).
- Assurez-vous d’une puissance laser optimale et sélectionnez les paramètres PMT HV/Offset pour collecter la fluorescence de l’échantillon.
- Ouvrez la barre d’outils « Acquisition ND » à partir de « Commandes d’acquisition ».
- Sélectionnez l’onglet « Configuration de la série Z » (assurez-vous que tous les autres onglets ne sont pas sélectionnés).
- Pendant le balayage en direct, concentrez-vous sur le haut de l’échantillon et appuyez sur le bouton « Top ».
- Concentrez-vous sur le bas de l’échantillon et appuyez sur le bouton « Bottom ».
- Entrez la taille de pas requise (ou appuyez sur le bouton de taille de pas optimisée).
- Appuyez sur le bouton « Exécuter maintenant ».
- Enregistrez les piles Z résultantes en tant que piles d’images Tiff individuelles (1 fluorochrome par pile Z d’image).
- Utilisez des piles Z d’images pour reconstruire les régions de volume 3D d’intérêt à l’aide d’un logiciel d’analyse 3D (par exemple, à l’aide d’Imaris x64 7.2.3 comme décrit ci-dessous).
- Démarrez le logiciel d’analyse.
- Choisissez le bouton « Surpasser » dans la barre d’outils pour la génération de volumes 3D.
- Ouvrez la première pile Z d’image couleur (par exemple, DAPI).
- Utilisez l'outil « ajouter un canal » pour ajouter des canaux de couleur supplémentaires, un canal par fluorochrome. Ainsi, un échantillon contenant à la fois des fluorochromes DAPI et Alexa Fluor 594 nécessitera deux canaux.
- Utilisez l’outil « Propriétés de l’image » pour définir les dimensions correctes en pixels (voxel) (XYZ), comme déterminé au point 3.7 ci-dessus.
- Utilisez l’outil « Réglage de l’affichage » pour modifier les couleurs des canaux selon vos besoins (par exemple, réglez le canal DAPI sur bleu, le canal Alexa Fluor 594 sur rouge).
- Pour positionner le volume 3D dans la fenêtre d’image, cliquez et faites glisser le volume à l’aide de la souris de l’ordinateur.
- Utilisez l’outil « Instantané » dans la barre d’outils pour générer des captures d’écran de l’image 3D.
- Utilisez l’outil « Animation » dans la barre d’outils pour générer des films de rotation d’échantillon 3D.
