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Toutes les procédures impliquant des participants humains ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles, nationales et internationales en matière de bien-être humain et ont été examinées par le comité d’examen institutionnel local.
1. Kératinocytes humains primaires génétiquement modifiés
REMARQUE : Utilisez des cellules de phénix amphotropes cultivées dans un milieu DMEM complet [DMEM + 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) + pen/strep] pour produire des virus permettant d’infecter les kératinocytes humains primaires. Les gènes d’emballage viral qui codent pour des protéines telles que gag-pol et l’enveloppe sont intégrés de manière stable dans le génome de la cellule du phénix, ce qui permet la production de virus lorsqu’il est transfecté avec un vecteur rétroviral. Les cellules Phoenix peuvent être transfectées avec une grande efficacité, ce qui permet une production de titres viraux élevés. Les virus produits à partir de cette ligne d’emballage peuvent également infecter une grande variété de cellules de mammifères, y compris les humains.
- Jour 1 : La veille de la transfection, ensemencez des cellules de phénix dans une plaque de 6 puits à une densité de 800 000 cellules par puits dans un milieu DMEM complet.
- Jour 2 : Le jour de la transfection, utiliser 3 μg de vecteurs rétroviraux par puits. Aliquote 3 μg de vecteur rétroviral dans un tube de 1,5 mL. Utilisez un mélange de 100 μL de DMEM et de 6 μL de réactif de transfection pour chaque 3 μg de vecteur. Mélangez 6 μL de réactif de transfection avec 100 μL de DMEM dans un tube de 1,5 mL. (Les vecteurs rétroviraux utilisés sont répertoriés dans le tableau des équipements/matériaux)
- Incuber pendant 5 min et ajouter le mélange de 106 μL dans le tube pré-aliquote contenant 3 μg de vecteur rétroviral. Mélanger et incuber à RT pendant 30 min. Ajoutez tout ce mélange goutte à goutte dans chaque puits des cellules du phénix.
- Jour 3 : Le lendemain de la transfection, retirez le support des cellules du phénix et ajoutez 2 ml de support DMEM complet frais. Le même jour, ensemencez les kératinocytes humains primaires dans des plaques de 6 puits à une densité de 75 000 cellules par puits. Maintenir les kératinocytes dans un milieu exempt de sérum de kératinocytes (KCSFM) avec des antibiotiques (pen/strep).
note: Des kératinocytes humains primaires ont été achetés. Les cellules peuvent être achetées auprès de différents fournisseurs (répertoriés dans le tableau Matériaux).
- Jour 4 : Récoltez le milieu des cellules de phénix transfectées, qui contiennent maintenant des particules virales. Passez le média à travers un filtre de 0,45 μm à l’aide d’une seringue (pour éliminer toutes les cellules de phénix contaminantes) et placez 2 mL sur les kératinocytes (plaqués à 75 000 cellules/puits la veille). Ajouter du bromure d’hexadiméthrine (5 μg/mL) dans le milieu pour aider à prévenir le processus d’infection. Les titres viraux sont de ~1 x 107 TU/mL.
- Faites tourner les plaques à 6 puits dans une centrifugeuse à 200 x g pendant 1 heure à RT. Après l’essorage, retirez le support contenant le virus et lavez les cellules une fois avec 1x PBS avant d’ajouter KCSFM.
- Jour 5 : Infecter à nouveau le même lot de kératinocytes qu’à la section 1.4, en utilisant 2 mL de média filtré contenant du bromure d’hexadiméthrine (5 μg/mL). Faites-le tourner à 200 x g pendant 1 heure à RT pour éliminer les supports contenant le virus et lavez-le avec 1x PBS, puis ajoutez KCSFM.
note: Sélectionner les kératinocytes à l’aide d’un médicament s’il existe un marqueur sélectionnable sur le vecteur rétroviral et les développer pour une utilisation dans l’analyse en aval ou dans des applications telles que les cultures organotypiques.