Essai de formation de colonies de kératinocytes : un essai in vitro pour évaluer la capacité des kératinocytes à se développer en colonies

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Récolte et ensemencement des kératinocytes primaires

1. Euthanasier quatre à cinq souris femelles adultes par inhalation de CO₂ conformément aux normes approuvées des installations animales/IACUC. Cependant, ce protocole peut également être utilisé pour les souris femelles/mâles uniques.
   1. Coupez environ 9 cm² de la fourrure dorsale à l’aide d’une tondeuse électrique et placez toutes les souris coupées dans un bocal de 500 ml contenant suffisamment de solution antiseptique de povidone iodée (pas de gommage) pour les couvrir pendant 1 à 2 min. Agitez bien le bocal pour enrober uniformément la solution antiseptique sur les souris.
   2. Videz la solution et rincez à l’eau claire jusqu’à ce que le liquide soit clair. Répétez le même lavage antiseptique suivi d’un rinçage à l’eau. Après le lavage antiseptique avec une solution iodée, trempez toutes les souris dans de l’éthanol à 70 % pendant 5 à 10 min
      REMARQUE : Les souris à la fourrure claire (par exemple, BALB/c) conserveront une légère couleur jaunâtre des lavages iodés antiseptiques, tandis que les souris plus foncées (par exemple, C57BL/6) ne le feront pas. Notamment, la viabilité cellulaire ou la croissance de la culture n’est pas affectée en raison de la couleur jaune.
2. Retirez délicatement la peau dorsale coupée à l’aide d’une pince à pouce et de ciseaux dans une hotte à flux laminaire. Placez la peau dorsale excisée dans un tube conique rempli de gentamycine PBS/2x. Évitez d’utiliser la peau latérale ventrale pour éviter la contamination des cellules mammaires en culture.
3. À l’aide d’une pince autoclave et d’un scalpel, placez une peau dorsale à la fois, côté poilu vers le bas, sur une boîte de Pétri mince. Commencez à gratter tout le tissu sous-cutané, y compris la graisse de la face ventrale du tissu cutané, jusqu’à ce qu’il soit semi-translucide. Essayez d’éliminer un maximum de traces de tissu sous-cutané sans déchirer la peau (partie du follicule pileux). De plus, ne grattez pas pendant une longue période et évitez le dessèchement de la peau.
   1. Conservez la peau grattée dans une solution de PBS jusqu’à ce que toutes les autres peaux restantes soient traitées. Ensuite, à l’aide d’un scalpel, coupez les peaux en bandes de 0,5 cm x 1-1,5 cm et placez le côté poilu vers le haut sur une boîte de Pétri stérile.
4. Pipeter soigneusement 20 ml de solution de PBS/2x Gentamicine mélangée à de la trypsine (0,25 %) dans une boîte de Pétri en plastique de 100 mm x 20 mm. À l’aide d’une pince stérile, transférez les peaux et faites-les flotter côté poilu vers le haut à la surface de la solution de trypsine pendant 2 h dans un incubateur à 32 °C.
   REMARQUE : Le temps et la température de trypsinisation sont cruciaux pour un bon rendement en kératinocytes primaires hautement cultivables. Bien que d’autres méthodes puissent fournir de bons rendements de cellules viables, la cultivabilité des kératinocytes a été moins satisfaisante.
   1. Pendant ce temps d’incubation de 2 h, enduire les plats d’un enrobage de collagène et les placer à 37 °C pendant 1 h (voir étape 1.1.2). Pour les tests clonogéniques, les boîtes de Pétri de 60 mm sont enrobées 24 h avant la récolte des kératinocytes pour permettre à la couche nourricière 3T3 irradiée de se fixer au fond et de s’étaler uniformément
      note: L’enrobage des boîtes de culture pour la culture clonogénique est très important pour une bonne fixation, la formation de colonies et la croissance/prolifération finale des kératinocytes épidermiques de souris.
5. Étape de grattage épidermique : Disposer une boîte de Pétri carrée en plastique stérile et créer une surface inclinée à 30° pour un grattage épidermique approprié avec 15 ml de milieu de récolte (voir le tableau 1). Retirez avec précaution une bande de peau flottante de la solution de trypsine à l’aide d’une pince incurvée. Ensuite, avec une nouvelle lame de scalpel, grattez l’épiderme et les poils dans le milieu.
   1. N’utilisez pas de force excessive, mais utilisez une force suffisante pour gratter l’épiderme ou affecter la viabilité cellulaire.
   2. Lors du grattage de l’épiderme, gardez la lame perpendiculaire au morceau de peau. Si la lame est inclinée vers le mouvement de la lame, il y a plus de risques de déchirure de la peau. Si la lame est inclinée à l’opposé du mouvement de la lame, il y a plus de risques d’ablation incomplète de l’épiderme.
6. Versez soigneusement le milieu de récolte contenant les cellules épidermiques grattées dans un pot stérile de 60 ml (autoclavable et réutilisable) avec une barre d’agitation magnétique de 1,5 pouce. Rincez la boîte de Pétri avec un milieu de récolte supplémentaire pour recueillir les cellules épidermiques restantes et porter le volume final à 30 ml. Utilisez un agitateur magnétique et remuez à 100 tr/min pendant 20 min à température ambiante. Ce processus éliminera les cellules épidermiques piégées des poils.
7. Placez une passoire à cellules stériles de 70 μm sur le dessus d’un tube conique de 50 mL. La crépine à cellules s’adapte sur le dessus d’un tube conique de 50 ml.
   1. Placez le bocal à l’intérieur d’une hotte de biosécurité. Retirez le barreau d’agitation et versez le contenu dans le filtre-filtre fixé à un tube conique de 50 ml. Filtrez les cheveux et les feuilles de couche cornée indésirables.
   2. Appuyez sur les poils avec les matériaux de la couche cornée à l’intérieur de la crépine et manipulez-les pour libérer les cellules ciliées piégées. Utilisez 5 mL de milieu de récolte pour permettre aux cellules piégées restantes de se libérer et de s’écouler dans le tube. Porter le volume total à 50 mL dans un tube conique.
8. Boucher le tube conique de 50 mL avec le filtrat de cellules et centrifuger à 160 x g pendant 7 min à 4 °C. Ensuite, aspirez le surnageant et ajoutez 5 mL de milieu de récolte. Enfin, remettez en suspension la pastille cellulaire en triturant doucement ~20x avec une pipette de 5 mL.
   1. À cette étape, conservez les cellules dans une glacière pour éviter toute agrégation. Ensuite, ajoutez 25 ml de substrat de récolte et triturez à nouveau (20-25x).
   2. Pour assurer une numération précise des kératinocytes à cette étape, prélever 1 mL de suspension cellulaire et ajouter 19 mL de milieu de récolte. Maintenant, la dilution de la cellule est de 1:20 dans un tube conique de 50 ml. Si les kératinocytes sont récoltés sur une seule souris, ajustez le volume de la suspension cellulaire. Par exemple, au lieu de 30 ml, utilisez 15 ml et faites une dilution de 1:10 pour compter les cellules.
9. Pipeter 0,5 mL de cellules diluées à partir du tube conique de 50 mL (dilution 1:20) et transférer dans un tube de microcentrifugation autoclavé de 1,5 mL. Retirer 0,2 mL (200 μL) du mélange de cellules dans un autre tube de microcentrifugation de 1,5 mL et ajouter un volume égal (200 μL) de solution de bleu de trypan à 0,4 %. Mélangez doucement cette solution 3 fois et transférez les cellules dans un hémocytomètre pour compter les kératinocytes nucléés.
   1. Marquez toutes les cellules bleu foncé positives pour le bleu trypan en tant que cellules mortes non viables, et notez les petites cellules dorées et rosâtres en tant que cellules viables. Ainsi, le rendement final en kératinocytes par souris devrait être d’environ 30 millions de cellules viables.
10. Centrifugez le tube conique d’origine de 50 mL (à partir de l’étape 1.8) pendant 7 min à 160 x g à 4 °C. À cette étape, remettez les cellules en suspension dans le milieu souhaité et effectuez la dilution requise pour l’ensemencement des cellules.
    1. Pour la culture de masse, ensemencez 2 à 4 millions de cellules d’or viables dans chaque boîte de Pétri de 35 mm dans un milieu de culture cellulaire (milieu de type KGM + suppléments pour les cultures monocouches) (voir tableau 1). Pour un essai clonogénique (formation de colonie), ensemencez 1 000 cellules par boîte de Pétri de 60 mm sur des couches nourricières 3T3 de souris suisse irradiées aux rayons X avec un enrobage de collagène et du milieu Willia E modifié avec des suppléments et du sérum.
    2. Utilisez un total de 2 à 4 ml de milieu pour les boîtes de Pétri de 35 mm et 60 mm, respectivement. Formuler également du DMEM et du Williams E medium obtenus auprès de l’ATCC avec des niveaux réduits de bicarbonate de sodium pour une utilisation à 5 % de CO₂.
11. Cultiver les cellules de culture (de masse ou clonogènes) à 32 °C, 95 % d’humidité avec 5 % de CO₂. Changez le substrat un jour après l’ensemencement initial pour la culture de masse, puis 3 fois par semaine par la suite. Cependant, pour les tests clonaux, le premier changement de milieu est de 2 jours après l’ensemencement cellulaire et de 3 fois par semaine par la suite.
12. Pour la culture clonale, cultivez les cellules à deux et quatre semaines d’intervalle. Une fois les cultures clonales terminées (2 ou 4 semaines), aspirez le milieu. Fixez les colonies dans du formol tamponné à 10 % pendant la nuit à température ambiante et colorez-les avec de la rhodamine B à 0,5 % dans de l’eau d’autoclave pendant 1 h. Ensuite, retirez la tache de rhodamine B à l’aide d’une pipette sur le bord de la boîte.
    1. Rincez la vaisselle à l’eau froide autoclavée jusqu’à ce qu’elle soit claire. Placez les plats inclinés sur le couvercle des plats et laissez-les sécher pour le comptage final des colonies. Notamment, lors de la réalisation d’un test de culture clonogénique, ne jamais pipeter <1 mL de cellules. Si les cellules sont concentrées, diluez en série la concentration cellulaire.

Tableau 1 : Recettes de solutions et de milieux.