Transgénèse vectorielle miniCoopR : une technique de criblage des gènes induisant le mélanome dans un modèle de tumeur de poisson-zèbre

Toutes les procédures impliquant des animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Dépistage des modificateurs de l’apparition du mélanome

1. Créez des clones d’entrée intermédiaire de Gateway par PCR, en amplifiant le cadre de lecture ouvert complet des gènes d’intérêt (GOI) et en les recombinant en pDONR 221 à l’aide de la clonase II de BP (Invitrogen). Utiliser la technologie Multisite Gateway (Invitrogen) pour recombiner p5E_mitfa, pME_GOI, Tol2kit #302 p3E_SV40polyA et miniCoopR afin de placer les gènes d’intérêt sous le promoteur mitfa dans le vecteur miniCoopR (Figure 1A).
2. Injecter 25 picogrammes de chaque clone avec 25 picogrammes d’ARNm de la transposase Tol2 dans une cellule Tg(mitfa :BRAFV600E) ; p53(LF) ; Mitfa(LF)Embryons de poisson-zèbre triplement homozygotes comme décrit précédemment. Incuber les embryons injectés à 28,5 °C. Retirer les embryons morts à 24 hpf.
3. Sélectionnez des animaux transgéniques avec des mélanocytes sauvés à 72 hpf en plaçant la boîte de Pétri contenant les embryons injectés sur un microscope à dissection sous une lumière incidente sur un fond blanc (Figure 1A).
4. Transférer les animaux dans des réservoirs de 3 L dans la nurserie de l’installation de poisson-zèbre à 4 dpf.
5. À 2 mois, sélectionner les animaux présentant au moins une aire de sauvetage de mélanocytes supérieure à 4 mm² (Figure 1A). Il existe une forte corrélation entre le degré de sauvetage des mélanocytes à 72 hpf et le degré de sauvetage des mélanocytes à 2 mois. Lorsque les embryons avec sauvetage des mélanocytes sont prélevés à 72 hpf, la majorité d’entre eux (~80 %) auront au moins une zone de sauvetage des mélanocytes supérieure à 4 mm² à 2 mois.
6. Dépister chaque semaine les animaux sélectionnés pour détecter la présence de tumeurs (Figure 1B). Il existe une forte corrélation entre les changements histopathologiques et morphologiques. La transition de bénigne à maligne est reconnue comme un changement morphologique lorsque les lésions se soulèvent de la surface de l’animal. Isolez des animaux porteurs de tumeurs pour l’étude.
7. Dessinez des courbes de survie sans mélanome avec l’âge en semaines sur l’abscisse et le pourcentage de survie sans mélanome sur l’ordonnée. Les animaux dont les mélanocytes expriment un gène d’intérêt sont comparés à des animaux témoins qui expriment l’EGFP (enhanced green fluorescent protein) dans les mélanocytes (Figure 1C). L’apparition tumorale médiane chez les animaux ayant reçu une injection de miniCoopR-EGFP est d’environ 18 semaines. Déterminez si les deux courbes sont statistiquement différentes à l’aide d’un test de classement logarithmique.

Graphique 1. Dépistage des modificateurs de l’apparition du mélanome à l’aide du test miniCoopR. A) Schéma du test miniCoopR. Embryon avec des mélanocytes sauvés (pointe de flèche) contenant le vecteur miniCoopR et le gène d’intérêt. Barre d’échelle = 250 μM. Adulte avec un sauvetage de mélanocytes de plus de 4 mm(pointe de flèche). Barre d’échelle = 500 μM B) MiniCoopR-EGFP a sauvé un poisson-zèbre avec une tumeur amélanotique et une tumeur pigmentée (pointes de flèches). C) Courbe représentative de survie sans mélanome comparant les tumeurs exprimant l’oncogène SETDB1 et un gène de contrôle EGFP (p = 9,4×10-7, log-rank χ2).