Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Coloration par anticorps des mélanocytes à cochenilles
- Tampon d’appoint PO4 avec 80 mL 0,1 M Na2HPO4 et 20 mL 0,1 M NaH2PO4. Assurez-vous que le pH est de 7,3. Préparez 2 tampons fixes contenant 8,0 g de saccharose, 0,15 ml de CaCl2 0,2 M et 90 ml de tampon PO4 0,2 M, pH 7,3. Si nécessaire, ajustez le pH à 7,3 avec du NaOH ou du HCl, puis augmentez à 100 ml avec un tampon PO4.
- Peser jusqu’à 300 mg de PFA solide et l’ajouter dans un tube de microcentrifugation. Ajouter 5 mM de NaOH à un volume égal à 4,5 fois la masse, en mg, de PFA (par exemple 450 ul 5 mM de NaOH à 100 mg de PFA). Chauffer à 60-70 °C en secouant de temps en temps jusqu’à ce que le PFA soit dissous. Faites tourner les particules restantes et récupérez 20 % de surnageant PFA. Rendez-le frais à chaque fois.
- Préparez une solution de fixation contenant 1 tampon fixe et 4 % de PFA.
- Anesthésier le poisson avec 0,17 mg/mL de tricaïne.
- À l’aide de la lumière incidente sous un microscope à dissection, épiler les écailles dorsales à l’aide d’une pince pointue à pointe fine, en prenant soin de ne pas endommager la moitié de l’écaille contenant des mélanocytes (Figure 1A). Placez les écailles directement de la pince dans une solution de fixation de 1 mL et incubez à température ambiante, tout en les retournant, pendant ≥ 2 heures. Transférez les poissons dans l’eau des poissons et surveillez-les pour confirmer que le rétablissement a réussi.
- Pour blanchir les mélanocytes pigmentés, laver les écailles fixes au PBST (1x PBS pH 7,4, 0,1 % Triton X-100) 2 fois pendant 5 min à température ambiante. Ajouter 1 ml de solution d’eau de Javel fraîchement préparée contenant 0,4 ml de KOH à 10 % et 0,15 ml de 30 % de H2O2 dans 5 mL avec du dH2O. Mettez un parafilm ou des verrous de capuchon pour empêcher le gaz d’ouvrir les tubes. Continuez à blanchir jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de pigment (10 min en général) (figures 1B, C). Laver au PBST quatre fois pendant 5 minutes à température ambiante.
- Bloquer pendant au moins 30 minutes dans une solution en bloc composée de 1 PBS pH 7,4, 0,2 % de Triton X-100, 2 mg/mL de BSA, 1 % de DMSO, 0,02 % de NaN3 et 2 % de sérum d’agneau. Laisser de côté NaN3 si le développement présente une réaction HRP.
- Incuber avec l’anticorps primaire dans une solution en bloc pendant la nuit à température ambiante. Vous devez disposer d’au moins 400 μL de solution sur les échantillons pour les maintenir immergés.
- Lavez la balance 3 fois pendant 30 min dans du PBST à température ambiante.
- Incuber avec l’anticorps secondaire de 2 h à toute la nuit dans une solution en bloc à température ambiante.
- Colorer pendant 10 min avec PBST + 0,1 μM DAPI.
- Laver 3 fois pendant 5 min avec PBST.
- Montez les écailles sur une lame de verre dans une goutte de vectashield de sorte que le côté concave des écailles soit orienté vers le bas vers la diapositive et placez une lamelle de verre dessus dessus. Scellez les bords de la lame avec du vernis à ongles transparent et observez les lames au microscope à fluorescence (Figure 1D, E, F, G).
