Essai de transplantation sous-cutanée : une méthode de transplantation de cellules de mélanome d’un donneur à un modèle de poisson-zèbre receveur

Résumé

Source : Iyengar, S. et al. Dépistage des modificateurs de mélanome à l’aide d’un modèle de tumeur autochtone de poisson-zèbre. J. Vis. Exp.(2012)

Cette vidéo décrit la méthode de transplantation de cellules tumorales du modèle de poisson-zèbre donneur porteur de mélanome à un poisson-zèbre Casper receveur immunodéprimé. Il aide à visualiser la greffe et la prolifération tumorale chez le poisson receveur.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Essai de transplantation

1. Préparez le poisson Casper receveur âgé de 2 à 3 mois en l’irradiant avec une irradiation gamma de 25 Gy un jour avant la transplantation. Laissez le poisson se rétablir dans l’eau du poisson.
2. Euthanasier un poisson porteur d’une tumeur selon les directives de l’établissement. Plus précisément, un poisson est placé dans un plat avec 0,6 mg/mL de tricaïne jusqu’à ce que le mouvement des branchies cesse.
3. Coupez la tumeur et mettez-la dans une boîte de Pétri avec un filtre d’environ 5 ml stérilisé 0,9x PBS avec 5 % de FBS. Coupez la tumeur en dés avec un rasoir pendant qu’elle est en solution.
4. En travaillant à température ambiante, triturez avec une pipette P1000 pour obtenir des cellules individuelles. Augmenter le volume à 25 mL avec un filtre stérilisé 0,9x PBS avec 5 % FBS.
5. Filtrer à travers un filtre à mailles de 40 μM.
6. Faites tourner une centrifugeuse de table Eppendorf 5810R à 1 500 tr/min (453 rcf) pendant 10 min.
7. Retirez le surnageant et faites la suspension cellulaire à la concentration approximativement souhaitée (supposons 10 7 cellules pour une tumeur de 100 mm³).
8. Calculez le nombre exact de cellules à l’aide d’un hémocytomètre et diluez la suspension cellulaire de manière à ce que le volume final d’injection soit d’environ 5 μL. Par exemple, si 50 000 cellules doivent être injectées, la suspension cellulaire doit être diluée à une concentration finale de 10 000 cellules/μL. Agitez le tube contenant la suspension cellulaire toutes les quelques minutes pour éviter l’agglutination des cellules.
9. Lavez une seringue Hamilton 701 N 10 μL de calibre 26s (pointe biseautée) 2 à 3 fois avec de l’éthanol à 100 % et du PBS 0,9x. Chargez la seringue avec 5 μL de suspension cellulaire.
10. Anesthésier le poisson récepteur irradié dans de la tricaïne à 0,17 mg/mL. Placez le poisson sur le côté sur un Kimwipe humide (Figure 1A).
11. Stabilisez le poisson d’une main et insérez l’aiguille avec le biseau vers le haut à un angle de 45° dans le flanc du poisson au-dessus de la cavité péritonéale à mi-chemin entre la limite postérieure du cerveau postérieur et le bord antérieur de la nageoire dorsale. Appuyez doucement sur le piston (figure 1B).
12. Laissez les poissons se rétablir dans l’eau douce des poissons et observez-les quotidiennement pour détecter la greffe tumorale (Figure 1C). Si une greffe a eu lieu, une croissance continue et le développement de la maladie peuvent également être observés.

Résultats

Graphique 1. Transplantation de cellules de mélanome. A) Poisson-zèbre Casper non injecté. Barre d’échelle = 500 μM. B) Site de transplantation sous-cutané (pointe de flèche) sur un receveur Casper irradié immédiatement après l’injection avec 50 000 cellules de mélanome. Barre d’échelle = 200 μM. C) Receveur ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Réactifs de recombinaison de passerelle	Invitrogen
miniCoopR
casper Poisson-zèbre
Seringue 701N 10 μl	Hamilton/Fisher	Référence 14-824
Filtre 40 μM	BD Faucon/Pêcheur	Référence 352340
FBS	Invitrogen	26140079