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1. Préparation des milieux et des réactifs
- Préparation de 200x de stock de phosphate de 2-ascorbique
- Dissoudre 29 mg d'acide L-ascorbique 2-phosphate par 5 mL de solution de milieu d'aigle modifié (DMEM) de Dulbecco et filtrer à travers un filtre à membrane de 0,22 μm. Conserver sous forme d’aliquotes stériles de 0,25 mL à -20 °C.
- Ajouter 0,25 mL d’aliquote de 200 x l’acide L-ascorbique 2-phosphate à chaque 50 mL de milieu fibroblastique (DMEM avec 1 % de L-glutamine et 10 % de sérum fœtal bovin) le jour requis, pour une concentration finale de 0,1 mM d’acide L-ascorbique 2-phosphate.
- Préparation du milieu de croissance des kératinocytes
- L’isolement et la culture de kératinocytes primitifs du carcinome épidermoïde (CSC) ont été décrits précédemment. La préparation des milieux de croissance des kératinocytes y est également décrite.
- En bref, préparez les médias comme suit :
300 mL de DMEM et 100 mL de F-12 de Ham complétés par 10 % de FBS
0,4 mg/mL d’hydrocortisone
5 mg/mL insuline
10 ng/mL EGF
5 mg/mL de transferrine
8,4 ng/mL de toxine cholérique
13 ng/mL de liothyronine
1x solution de pénicilline-streptomycine
2. Construction in vitro d’une matrice native dérivée de fibroblastes dans un milieu enrichi en acide L-ascorbique 2-phosphate
- Ensemencez 200 000 fibroblastes par puits dans des plaques à 6 puits (20 000 cellules/cm2) dans un milieu de fibroblastes complété par de l’acide L-ascorbique 2-phosphate. Réalimenter tous les 2-3 jours avec 2-5 mL de milieu. (Remarque : la fréquence et le volume de réalimentation peuvent être ajustés pour répondre aux besoins individuels des différentes cellules.)
- Au bout de 6 semaines, une épaisse couche de cellules noyées dans la matrice extracellulaire se formera, visible à l’œil nu (Figure 1). Pour libérer cette couche de la plaque de culture tissulaire, grattez doucement la circonférence de la matrice avec une pointe de micropipette de 1 ml, puis poussez les bords de la matrice vers le centre du puits. Cette couche de cellules et de matrice (matrice native) doit être facilement détachable de la surface de la plaque et flotter maintenant dans le support. Étalez la matrice native dans le support pour éviter qu’elle ne se replie sur elle-même.
- Laissez la matrice native flotter et se remodeler pendant 5 jours, en changeant de support tous les 2-3 jours. En raison de la résistance à la traction et du remodelage intrinsèque à l’intérieur de la matrice, la matrice se contractera considérablement et se réduira à une matrice native plus petite, mais plus épaisse, prête à être utilisée pour le test d’invasion.
3. Dosage de l’invasion avec des kératinocytes tucaux SCC
- Prélevez doucement la matrice native à l’aide d’une pince émoussée et transférez-la sur un filet en nylon. Une fois sur le filet en nylon, étalez doucement la matrice pour la poser aussi à plat que possible à l’aide d’une pointe de micropipette de 1 ml et d’une pince émoussée.
- Préparez les cylindres clonaux stériles en étalant une petite quantité de vaseline stérile à une extrémité.
- Placez les cylindres clonaux sur la matrice native, avec la vaseline vers le bas. Il s’agit d’assurer une étanchéité parfaite entre la matrice native et les cycles clonaux.
- Ajoutez des cellules cSCC dans les cylindres clonaux (250 000 cellules dans 100 μl de milieu de croissance des kératinocytes).
- Retirez les cylindres clonaux après 6 heures lorsque les cellules cSCC se sont installées sur la matrice native.
- Soulevez le filet en nylon avec la matrice native et les cellules cSCC jusqu’à l’interface air-liquide sur un support en treillis métallique en acier inoxydable plié.
- Ajouter un milieu de croissance de kératinocytes complété par de l’acide ascorbique jusqu’à ce que le niveau du milieu touche le bas de la matrice native.
- Changer de milieu tous les 2-3 jours et récolter à 7 et 14 jours, après l’ensemencement des cellules cSCC.
