Article de méthode
Pseudofracture, un modèle reproductible murin de traumatismes musculo-squelettiques stérile, permet une évaluation de la fin du terme de post-traumatique des réponses immunitaires. Cet article décrit l'exécution de procédure de l'étape par étape le modèle, y compris le potentiel de combinaisons modèle expérimental pour permettre l'étude des traumatismes multiples.
Suite à un traumatisme il ya un début hyper-réactif réponse inflammatoire qui peut conduire à une défaillance multiviscérale et une mortalité élevée chez les patients traumatisés; cette réponse est souvent accompagné d'une immunosuppression retardée qui ajoute les complications cliniques de l'infection et peut aussi augmenter la mortalité 1-9. De nombreuses études ont commencé à évaluer ces changements dans la réactivité du système immunitaire suite à un traumatisme. 10-15
Des études immunologiques sont fortement soutenus par la grande variété des cultures transgéniques et des souris knockout disponibles pour la modélisation in vivo;. Ces aides souches dans les enquêtes détaillées pour évaluer les voies moléculaires impliquées dans les réponses immunologiques 16-21
Le défi de la modélisation expérimentale murin est un traumatisme enquête à long terme, comme les techniques de fixation des fractures chez la souris, peut être complexe et pas facilement reproductible. 22-30
Ce modèle pseudofracture, un modèle d'un traumatisme facilement reproduite, surmonte ces difficultés en immunologiquement imitant un environnement de fracture extrémité, tout en permettant la liberté de mouvement dans les animaux et la survie à long terme sans la constante, l'utilisation prolongée de l'anesthésie. Le but est de recréer les caractéristiques d'une fracture des os longs; muscle blessé et des tissus mous sont exposés à l'os endommagé et la moelle osseuse sans casser l'os natif.
Le modèle pseudofracture compose de deux parties: une blessure musculaire bilatérale écraser pour les membres postérieurs, suivie par l'injection d'une solution d'os dans ces muscles blessés. La solution d'os est préparé par la récolte des os longs des deux membres postérieurs de l'âge et le poids correspondant donateurs syngéniques. Ces os sont ensuite broyées et remises en suspension en tampon phosphate salin pour créer la solution os.
Fracture du fémur bilatérale est un modèle couramment utilisé et bien établie d'un traumatisme des extrémités, et a été le modèle comparatif au cours du développement du modèle pseudofracture. Parmi la variété des modèles disponibles de fracture, nous avons choisi d'utiliser une méthode fermée de fracture avec lésion des tissus mous comme notre rapport à la pseudofracture, car nous voulions une solution stérile encore proportionnellement graves modèle périphérique traumatisme tissulaire. 31
Le choc hémorragique est une conclusion commune dans le cadre d'un traumatisme sévère, et l'hypoperfusion globale ajoute un élément très pertinent pour un modèle de traumatisme. 32-36 Le modèle pseudofracture peuvent être facilement combinés avec un modèle de choc hémorragique d'un modèle de traumatismes multiples de gravité élevé 37.
1. Instrument de préparation du terrain et de chirurgie:
Toutes les procédures expérimentales sont réalisées en utilisant des techniques aseptiques. Avant de commencer, la zone expérimentale doit être soigneusement nettoyé et stérilisé. La paillasse doit être désinfectée, sécher à l'air et ensuite essuyer avec de l'alcool à 70%. Placez un coussin bleu et chirurgicale champ stérile vinaigrette dans la zone des travaux expérimentaux.
Tous les matériaux et les instruments sont stérilisés autoclave avant utilisation. Les seringues et aiguilles stériles sont reçus. Le chercheur doit être convenablement vêtu d'une blouse de laboratoire, un masque chirurgical et des gants chirurgicaux stériles.
Nos instruments chirurgicaux sont stérilisés autoclave chaque soir. Ils sont lavés après la chirurgie en utilisant un savon antibactérien et de l'eau. Ils sont mis à sécher sur un tapis bleu propre chirurgicale. Elles sont ensuite soigneusement placés dans une poche de stérilisation et stérilisés pour une utilisation ultérieure.
Allumez le stérilisateur à billes chaude pour s'assurer qu'elle atteigne la température appropriée - 300-350 ° F avant de commencer l'expérience. Ce stérilisateur sera utilisé pour nettoyer les instruments entre les procédures expérimentales sur des souris respectifs. Obtenir un plateau en acier inoxydable instrument et remplissez-le 1 / 3 de la voie avec 70% d'éthanol. Il devrait y avoir suffisamment d'éthanol à 70% pour couvrir vos instruments chirurgicaux. Mettez le coussin chauffant circulant et placez un coussin chirurgicale bleu sur elle et puis d'un champ stérile vinaigrette sur le dessus de cela. Cet appareil est utilisé pour assurer une chaleur suffisante de la souris durant la procédure expérimentale et la période de récupération. Placez tous les instruments stériles, gaze, seringues, aiguilles et un tube de micro 1.5ml sur le pansement champ stérile. Soyez prudent lors de l'ouverture des instruments stériles et autres éléments, ne pas les contaminer en les touchant. Il est préférable d'utiliser des gants stériles lors de cette procédure d'installation.
2. Modèle Pseudofracture - Procédures expérimentales:
1. L'induction de l'anesthésie et le positionnement de la souris.
Commencez par administrer une injection intrapéritonéale de pentobarbital (70mg/kg). Ceci est accompli en commençant par soulever la souris de sa cage à l'aide de l'extrémité proximale de sa queue. La souris doit ensuite être pesés pour calculer la dose correcte d'anesthésiques. Ensuite, placez l'animal sur le dessus de la cage, tout en tenant sa queue. Prenez la peau du cou de la souris avec le pouce et le majeur de chaque côté de la souris juste derrière les pattes avant. L'index est utilisé pour tirer la peau sur la région de la tête / nuque et partiellement immobiliser la tête. La queue de la souris est maintenu entre l'auriculaire et l'annulaire tandis que le doigt d'anneau est enfoncé dans la région lombaire de la colonne vertébrale de la souris. L'anesthésie doit prendre pleinement effet dans les 5 minutes environ, et devrait être confirmé par le test de réflexe.
Après que l'animal est endormi, placez la souris dans la position couchée sur une planche de plexiglas et l'utilisation d'une technique boucle lâche bande pour les immobiliser en collant leurs extrémités. La technique consiste simplement à boucle lâche couper de fines bandes de ruban adhésif et la bande d'emballage vaguement autour de la portion distale de chaque extrémité. Le ruban est ensuite collé à lui-même et la gauche sur le ruban est attaché à la planche. Cela permet à la manipulation expérimentale à effectuer d'une manière cohérente ainsi que d'assurer les extrémités de la souris assumer une position plus naturelle. Régions abdominale, inguinale, et la cuisse de l'animal sont alors rasé à l'aide de nos tondeuses Oster A5 (la taille 40 lames), pour aider à maintenir un champ stérile. Une gaze de 4x4 est aspergé avec de la Bétadine et de la zone chirurgicale est alors effacé à stériliser. Un pansement champ stérile est ensuite plié et drapé à travers la souris pour permettre une exposition de seulement les membres inférieurs et la tête.
Après l'immobilisation et la stérilisation, placer un cône de nez avec de l'isoflurane sur le nez de la souris pendant quelques secondes avant le début de la procédure expérimentale. Le cône de nez est constitué d'un tube conique 50cc rempli de gaze. La moitié de l'extrémité inférieure du tube est découpé en créant un espace pour le nez de la souris pour s'adapter. Un capuchon (fond d'un conteneur de stockage de tissus à savoir côté jar bouche droite de large) est placé sur l'extrémité coupée de la forme conique pour assurer les vapeurs d'isoflurane dans le tube lorsqu'il n'est pas utilisé. Un ml d'isoflurane doit être ajoutée à la gaze dans le cône. Une attention méticuleuse doit être accordée à la souris pendant l'utilisation de l'anesthésie et en particulier l'utilisation de l'isoflurane via le cône de nez. Une fois une respiration de l'animal commence à ralentir, l'expérience peut commencer, et le cône de nez doit être retiré et fermé.
Si l'anesthésie n'est nécessaire pendant toute une partie de l'expérience, le pentobarbital supplémentaires peuvent être injectés ou administrés isoflurane. Des méthodes alternatives de l'administration isofluorane sont disponibles et mises à jour des lignes directrices recommfin à l'utilisation d'un vaporisateur de précision pour permettre un meilleur contrôle de l'anesthésie, si c'est faisable. Toutefois, attention à la physiologie respiratoire de la souris doit être garantie par une de ces méthodes.
2. Expérimentation Pseudofracture.
Les pseudo-fracture est une combinaison de lésions des tissus mous suivie par injection de solution d'os au muscle blessé et est réalisée bilatéralement aux membres postérieurs. La solution osseuse doit être préparé avant toute manipulation expérimentale de la souris receveuses commence.
3. Solution de l'os de préparation.
La solution préparée de l'os d'une souris donneuse sera suffisant pour trois souris receveuses. Une souris syngéniques donateurs doit être utilisé qui est l'âge et du poids adapté à la souris receveuse expérimental.
La souris donateurs seront euthanasiés avec l'isoflurane en inhalation. Le donateur sera ensuite collé sur le bord en plexiglas avec une attention particulière à la bande les extrémités inférieures seulement à la pointe du pied. Les extrémités inférieures doivent être soigneusement rasée et bien couverts dans la bétadine, puis lavée à l'alcool pour la stérilité. Ensuite, le fémur et le tibia sera enlevée chirurgicalement de manière stérile des deux membres inférieurs. Pour enlever les os longs des membres inférieurs, faire une incision chirurgicale dans la peau dans la région inguinale, et de continuer à couper la peau sur toute la longueur de l'extrémité, jusqu'à la cheville. Rétracter la peau, et le disséquer loin du fascia sous-cutané et du muscle à la fois sur les aspects médial et latéral pour une exposition maximale. Insérer une lame des ciseaux sous les muscles qui se trouvent antérieur et latéral du tibia (jambier antérieur, extenseur commun des orteils, muscle long extenseur du hallicus, long péronier latéral, court fibulaire) et faites glisser la lame proximale et distale de lever les muscles proprement loin de la sous-jacentes des os. Répétez cette technique sur la partie inférieure postérieure et médiale du tibia pour séparer les muscles en dessous du tibia (gastrocnémien, soléaire, plantaire grêle, jambier postérieur, fléchisseurs des orteils, fléchisseur hallicus longus). Un effort minimal additionnel devrait être utilisé sur le côté postérieur en glissant distal, afin de casser le péroné loin du tibia. À l'extrémité proximale de ces muscles de la jambe coupé les tendons aussi près que possible de leurs insertions et rétracter les muscles du côté distal, tout en tirant sur le groupe musculaire ainsi que la baisse de la mode un petit remorqueur va libérer les attaches distales de ces muscles de l'articulation de la cheville. L'articulation de la cheville peut être coupé par le biais directement avec les ciseaux. Ne détachez pas le tibia sur le fémur à ce point! Cette connexion donne levier supplémentaire qui aidera à la dissection du fémur de l'articulation de la hanche. Suivre une technique similaire pour la libération des muscles du fémur et d'effectuer cette fois en arrière et dedans et en dehors aussi, si nécessaire. Couper la fixation distale de ces groupes de muscles pour les libérer de l'articulation du genou. Poursuivre la dissection et de suivre sous les muscles de disséquer la fin du fémur hors de l'articulation de la hanche. Pour aider à cette dissection, l'incision cutanée doit être étendu aussi loin que nécessaire pour obtenir une exposition adéquate. Mouvement du fémur à l'articulation de la hanche peut aider à localiser l'extrémité proximale du fémur lors de la dissection.
Une fois le fémur (avec joint tibia) est retiré de la souris donneuse les placer sur une 4x4gauze stérile. Les deux os peuvent être séparés à l'articulation du genou simplement en saisissant chaque os dans une main séparée et tordant avec précaution / rotation des deux os dans des directions opposées le long de leur axe long. Une dissection douce et de manipulation de ces deux os est recommandé, car ils peuvent facilement être fracturé avec tout l'effort au cours de la manipulation manuelle. Pour retirer les attaches des tendons restant de l'os longs, utilisez un morceau de gaze stérile sèche 4x4 enroulé autour de la longueur de l'os. Saisissez cette gaze serré contre l'os une tirez sur toute la longueur de l'os de plusieurs fois, ce sera gratter les tissus restants de la surface de l'os, car ils adhèrent à la gaze et d'être rapidement et facilement arrachée de l'os. Les ossements recueillis devraient alors être placés directement dans un tube de micro 1.5ml stérile et placés sur la glace pour le transport.
Ces quatre os donateurs seront prises pour une enceinte de sécurité biologique pour la préparation de la solution os. La hotte doit être soigneusement désinfectés avant chaque utilisation, placez un champ stérile pansement sur la zone de travail au sein de la hotte. Placer un mortier et un pilon stériles, stériles tubes 8 ml et de phosphate stérile saline tamponnée (PBS) dans la zone de travail. Un 1ml pipetteman, et des conseils respectifs devraient être disponibles dans le capot.
Une paire de forceps stériles doivent être utilisés pour enlever les os récoltés de façon stérile du tube de micro 1.5ml et placé dans le mortier, le pilon seront ensuite utilisées pour broyer les os délicatement. Phosphmangé une solution saline tamponnée est le véhicule utilisé pour remettre les fragments d'os pour l'injection. Pipeter 1ml de PBS dans le mortier et de continuer à écraser les fragments restants, avec des mouvements circulaires supplémentaires pour assurer la remise en suspension complète. Puis ajouter un autre 1 mL de PBS et de continuer à écraser pour créer la «solution de l'os». La solution devrait avoir une teinte rose, et il y aura des restes à gauche au fond du mortier qui ne peut pas être totalement rompu. Verser lentement la solution du mortier dans le tube 8ml, pour attraper le maximum de volume, tout en assurant la plus grande des vestiges restent dans le mortier. Cette solution d'os doit rester sur la glace jusqu'à son utilisation expérimentale et sera transféré à des seringues pour l'injection de 1 ml. Une aiguille calibre vingt sera plus tard attaché à la seringue 1ml contenant la solution os, afin de l'administrer à la souris. Cette taille grande aiguille a été choisi afin de s'assurer que tous les fragments d'os entrent dans la région lors de l'injection et de ne pas bloquer l'aiguille.
Avant l'injection de souris receveuse, une goutte de la solution os est placé sur une plaque de gélose MacConkey pour la culture (incubation de 48 heures 24). C'est pour garantir la stérilité de la solution de l'os. Le pH de la solution de l'os doit aussi être vérifié pour s'assurer un pH neutre.
4. Blessures des tissus mous.
Cette lésion des tissus mous est une blessure des membres postérieurs bilatéraux écraser. Le positionnement initial de la souris, avec des pattes arrière et latéralement en légère abduction rotation, aide à l'accessibilité du groupe musculaire correcte, les fléchisseurs du genou (biceps crural, demi-tendineux et les muscles semi-membraneux). Une grande hémostatique 18cm sera utilisée pour effectuer la blessure par écrasement. La répartition de la force de ces produits hémostatiques appliquée a été analysé et jugé 270psi utilisant Topaq Analysis System Pressure Sensor Products Inc par la pince hémostatique doit être serré autour de la musculature postérieure de la cuisse, le milieu le long du fémur, avec sa courbe convexe vers le fémur. Le hémostatique doit alors être verrouillée fermée pour le premier clic seulement, et de rester pendant 30 secondes. Une attention particulière à la mise en place de cette hémostatique est important - il ne doit pas être serrée sur le fémur, pour s'assurer qu'il n'est pas fracturée. C'est devraient être effectués d'une manière conforme à chaque fois de garantir une blessure reproductibles entre la souris. Cette blessure l'écrasement est effectué sur les deux extrémités inférieures.
5. Injection de la solution d'os.
La souris receveuse expérimentales seront anesthésiés et préparés comme décrit précédemment, et ont subi des blessures des tissus mous avant cette injection d'os.
La solution d'os seront ensuite injectés dans la musculature cuisse écrasée de souris receveuse bilatéralement. En utilisant une aiguille de calibre 20, 0,15 ml de cette solution sera injectée dans les muscles postérieurs de chaque cuisse. Entrez l'aiguille à travers la peau environ 2 ~ 3 mm et de prêter attention à la distance d'insertion de l'aiguille - vous vous sentirez comme la pointe du biseau touche juste contre le fémur, cette position est idéale. Injecter la solution d'os aujourd'hui. Retirer l'aiguille et placer rapidement un doigt ganté sur stériles du site d'injection pour arrêter toute circulation de retour de la solution de l'os de la plaie. Tenir ce doigt là pour quelques secondes.
La souris sera ensuite replacé dans la cage et a permis la pleine liberté de mouvement directement en tant que subventions d'anesthésie. Gestion de la douleur appropriés doivent être administrés que la souris se réveille.
6. Période de Post-operative/recovery.
La bande boucle lâche est enlevé et les animaux sont placés dans une cage propre, qui est gardé sur un coussin chauffant circulant pour la récupération après plusieurs heures. La chaleur appropriée devrait être assurée avec une lampe de chaleur supplémentaire si nécessaire.
L'alimentation et l'eau seront facilement disponibles.
Antalgique doit être administré comme les animaux commencent à se réveiller de l'anesthésie, afin de gérer correctement la douleur. La buprénorphine (0.1mg/kg) est injecté par voie sous cutanée comme les animaux commencent une activité physique, mais pas avant, afin de ne pas compromettre la fonction respiratoire.
Les souris doivent être constamment surveillés pendant l'anesthésie, jusqu'au rétablissement de l'anesthésie ou de point limite expérimental. Souris devrait également être très soigneusement surveillés dans la période postopératoire et aucun médicament contre la douleur supplémentaire nécessaire doit être administré au besoin. Surveiller l'activité des animaux physique, l'état respiratoire, de la nourriture et l'eau d'admission et tous les signes de détresse (respiration laborieuse, douleurs, les changements dans les habitudes de manger et boire) doivent être traitées en conséquence.
Placez vos instruments chirurgicaux en alcool de 70% et les essuyer avec une gaze stérile, puis les mettre dans le stérilisateur microbille pour ~ 20 secondes pour la stérilisation de l'animal. Retirer les instruments chirurgicaux et les pulvériser avec de l'alcool à 70% pour les aider à se rafraîchir. Placez-les sur le Stvinaigrette de terrain erile. Assurez-vous qu'il n'ya pas d'alcool à gauche sur les instruments qui s'égoutte dans les animaux suivant.
3. Comparative bilatéral type fracture du fémur - Procédures expérimentales:
La souris expérimentales seront anesthésiés et préparés comme décrit initialement. Une grande 18cm hémostatique doit être serrée autour du membre postérieur d'environ 2 à 3 mm au-dessus du genou avec sa surface convexe vers le genou. Placez votre pouce sur le dessus de la pince hémostatique serré et votre index entre les hémostatique et de la hanche. Soyez sûr de vous sentir le fémur, avant tordre si vous savez où vous êtes de rupture. Puis hémostatique tordre le sens antihoraire tout en tordant votre autre main dans le sens horaire.
Répétez la procédure avec la jambe controlatérale.
4. Modèle de traumatismes multiples - Procédure expérimentale pour la combinaison de Pseudofracture avec choc hémorragique:
Souris receveuse sera anesthésié et préparé comme décrit initialement. Les souris qui sont de subir un choc hémorragique en combinaison avec des pseudo-fracture aura canulation artère fémorale avant la procédure pseudofracture puis sera une hémorragie de ce cathéter une fois que la fracture de la pseudo-a été achevé.
5. Secrets de la réussite:
Général:
Préparation de la solution Os:
Blessures des tissus mous:
Injection de la solution Os:
6. Préoccupations après Opératif:
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Pseudofracture, un modèle reproductible murin de traumatismes musculo-squelettiques stérile, permet une évaluation de la post-traumatique des réponses immunitaires. Le modèle pseudofracture imite immunologiquement un environnement de fracture extrémité à travers les loisirs des caractéristiques d'une fracture des os longs: les muscles blessés et des tissus mous sont exposés à l'os endommagé et la moelle osseuse sans casser l'os natif 38,39 Une réponse biphasique immunitaire peut être vu ci-après. ...
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les directives et les règlements énoncés par le soin des animaux et du Comité institutionnel utilisation et la conduite de la recherche et le Bureau de conformité de l'Université de Pittsburgh, une institution AALAS / AAALAC accrédités. Sources animales comprennent Jackson Laboratories et Charles Rivers Laboratories. Tous les animaux subissent l'assurance santé complets grâce à chaque fournisseur ainsi que l'Université de Pittsburgh programmes internes de surveillance des animaux de la santé. Cette recherche est menée en conformité avec les principes du gouvernement américain pour l'utilisation des animaux vertébrés. Le programme est enregistré avec l'USDA, et a une lettre d'assurance avec le Bureau des services de santé publique du bien-être des animaux de laboratoire.
Source de financement / Nombre de biologie moléculaire de choc hémorragique GM053789
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Coussin chirurgical bleu | Fisher Scientific | 50-7105 | |
| Pansements de champ stériles | Fisher Scientific | NC9517505 | |
| Coussin chauffant circulant 18"x26" | Harvard Apparatus | py872-5272 | |
| Stérilisateur d’instrument à billes chaudes | VWR international | 11156-002 | |
| Plateau en acier inoxydable 8 » x 11" | VWR international | 62687-049 | |
| Panneaux en plexiglas (10x15x0.5cm) | Université de Pittsburgh Atelier | ||
| Rouleaux de ruban 1" | Corporate Express | MMM26001 | |
| 50cc tube conique | Tout fournisseur | ||
| large ouverture latérale droite (utilisé comme capuchon pour cône de nez) | VWR international | 159000-058 | |
| Oster A5 tondeuse avec lame de taille 40 | VWR international | 10749-020 | |
| Ciseaux chirurgicaux (droits – ; 12cm) | Fine Science Tools | 14068-12 | |
| Hemostats curved -18cm | Harvard Apparatus | 81331718 | |
| Forceps (0.8mm-tip, curved-10cm) | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| Gauze 4"x4" | Tout fournisseur | ||
| Tube microfuge 1.5cc | Tout fournisseur | ||
| Seau à glace | N’importe quel fournisseur | ||
| Mortier et pilon | Fisher Scientific | 12-961AA | |
| Seringue 1cc avec aiguille 25G | Fisher Scientific | 14-826-88 | |
| Aiguille 20G | Tout fournisseur | ||
| Pipetteman 1mL | Tout fournisseur | ||
| Pointes de pipette de 1 ml | Tout fournisseur | ||
| Falcon polystyrène 8 ml tubes | VWR international | 60819-331 | |
| Sachet de stérilisation 3 « x8 » | VWR international | 24008 | |
| Sachet de stérilisation 5 « x10 » | VWR international | 24010 | |
| MacConkey II Plaque de gélose | BD Biosciences | 221172 | |
| Alcool éthylique - 200 proof | Pharmco-AAPER[ | 70 %] | |
| Pentobarbital sodique (solution de nembutol sodique) | OVATION Pharmaceuticals | 70mg/kg | |
| Aerrane (Isoflurane) | Baxter Internationl Inc. | 99,9 % | |
| Triadine Povidone Iode (Bétadine) | Triade | ||
| Saline tamponnée au phosphate (PBS) | |||
| Buprénorphine HCl | Bedford Laboratories | 0,1 mg/kg |
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE
Demander une autorisation