Dans le protocole in situ pour Wings Nymphe papillon utilisant ribosondes

Résumé

Afin d'examiner l'expression des gènes dans les tissus des pupes de l'aile Bicyclus anynana, nous présentons un protocole optimisé pour les hybridations in situ en utilisant des ribosondes. Nous fournissons aussi des directives pour l'optimisation de ce protocole pour l'utilisation dans les ailes des pupes de espèces de lépidoptères autres.

Résumé

Nous présentons ici, en format vidéo, un protocole pour les hybridations in situ dans les ailes des pupes de l'anynana papillon Bicyclus utilisant ribosondes. Hybridations in situ, un pilier de la biologie du développement, sont utiles pour étudier la répartition spatiale et temporelle de l'expression des gènes dans le développement de tissus au niveau de la transcription. Si des anticorps qui ciblent les produits de protéine de transcription des gènes n'ont pas encore été développée, et / ou il ya de multiples copies du gène d'une protéine particulière dans le génome qui ne peuvent pas être différenciés en utilisant des anticorps disponibles, situs peut être utilisé à la place. Alors une technique in situ pour les disques ailes larvaires ont été offerts à la communauté papillon pour plusieurs années, le protocole actuel a été optimisé pour les ailes plus grandes et plus fragiles chrysalide.

Protocole

JOUR 1

1. Préparer les solutions suivantes:
   • 10x PBS
   • 1x PBS
   • 1x PBT
   • ddH ₂ O
     • Ajouter DEPC pour un volume total de 0,1% et secouer vigoureusement solutions.
     • Autoclave.
   • Fix paraformaldéhyde à 4% - à l'aide de PBS-DEPC
   • Solution de protéinase K - Si un précipité apparaît, vortexer vigoureusement avant de retirer aliquote
   • Tampon d'arrêt Digestion
   • Tampon de préhybridation
   • 50:50 PBT: tampon de préhybridation
   • Tampon d'Hybridation
     • Les solutions doivent être conservés sans RNase. Utilisez soit verrerie qui a été cu....

Discussion

Optimisation des protocoles existants

Hybridations in situ sur des disques de l'aile des larves ont été réalisées avec succès en utilisant des disques à partir des papillons coenia Précis (Carroll et al, 1994;. Keys et al, 1999;. Weatherbee et al 1999).. Le protocole actuel a été adapté à partir d'un protocole écrit détaillé disponible sur demande auprès du laboratoire Carroll pour colorations aile larvaire. Les changements que nous a fait servir à tenir compte des différences entre les tissus des larves et des nymphes d'.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Bain de fixation				4 % de paraformaldéhyde dans du PBS
PBT				0,1 % de Tween 20 dans du PBS
Solution de protéinase K				2,5mg/ml de protéinase K dans du PBT
Bain d'arrêt de la digestion				2 mg/ml de glycine dans du PBT
Bain de pré-hybridation				Pour 50 ml de PHB : 12 ml d’eau traitée au DEPC + 25 ml de formamide + 12,5 ml de SSC 20 x + 50 µl de Tween 20 + 500 µl de sperme de saumon à 10 mg/ml (sans RNase, dénaturé par la chaleur avant ajout à la solution).
Bain d'hybridation				Ajouter 1 mg/ml de glycogène au bain de pré-hybridation
Bain de blocage				50 mM Tris pH 6,8, 150 mM NaCl, 0,5 % d'IGEPAL (NP40), 5 mg/ml de BSA
Anti-DIG	Ac	Roche Group	11 093 274 910	Conjugué à la phosphatase alcaline
Kit de lavage et de blocage anti-DIG		Roche Group	11 585 762 001
Milieu de montage aqueux Crystal Mount		Sigma-Aldrich	C0612	Milieu de montage