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Ce protocole permet l'isolement axoplasme avec minimisation de la contamination tissu glial et vasculaire. La méthode des rendements d'environ 70 à 100 mg de protéines totales par axoplasme une semaine de 80 à 10 Wistar vieux rat.
1. Disséquer nerfs sciatiques
- Euthanasier deux rats par inhalation de CO 2 suivie par dislocation cervicale. Confirmer la mort par la palpation de l'absence de battement avant la dissection début.
- Nettoyer la zone de dissection avec 70% d'éthanol.
- Coupez la peau, les muscles séparer et isoler nerf sciatique en utilisant des ciseaux et des pinces attentivement, sans endommager les vaisseaux sanguins. Disséquer les deux nerfs sciatiques (environ 1,5 cm chacune) de chaque animal et de collecter toutes les quatre nerfs dans un eppendorf de 500 pl de PBS 0,2 X + inhibiteurs, conservés sur la glace.
- Transférer le culot de segments plats en plastique contenant au moins 2 mL de PBS inhibiteurs de protéase 0,2 x +.
- Retirez l'épinèvre des nerfs à l'aide de pinces fines dans le champ binoculaire. Séparez les fascicules très soigneusement jusqu'à ce qu'ils deviennent troubles et commencent à flotter sur la surface de solution. Cette étape devrait être pratiqué jusqu'à ce qu'il puisse être effectué rapidement et avec précision (ne pas prendre plus de 10 minutes par nerf).
2. L'incubation, lavage et d'élution
- Transfert séparés fascicules d'un nouveau tube Eppendorf avec 500 ul de PBS contenant 0,2 x inhibiteurs de protéase pour une incubation de 2 h à température ambiante.
- Laver au moins 3 fois avec 1 ml du même tampon en transférant les fascicules du tube Eppendorf à tube Eppendorf et agiter pendant 5 min après le transfert.
- Pour enlever l'excès de liquide mis les fascicules dans un tube eppendorf de nouveaux vides et puis de transférer les fascicules d'un nouveau tube Eppendorf avec 300 ul de PBS 1X contenant inhibiteur de protéase pour une incubation pendant 20-30 min à température ambiante.
- Centrifuger 10 min à 10000 xg à 4 ° C.
- Prenez le surnageant et mesurer la concentration de protéines. Ceci est votre préparation axoplasme.
3. Les résultats représentatifs
Figure 1. Axoplasme Western blot comparant isolé par la méthode manuelle serrer avec des échantillons isolés axoplasme comme indiqué dans ce protocole. Notez la réduction des niveaux d'albumine et de la GFAP, protéine du sang qui représente et les contaminations de cellules gliales, respectivement. En revanche, la tubuline axonale b3 est enrichi dans cette préparation, indiquant un niveau élevé de protéines axonales.