Toxoplasma gondii Formation paroi du kyste dans la moelle osseuse Activé macrophages dérivés et Conditions Bradyzoite

Summary

Toxoplasma gondii se convertit en une forme un kyste, en réponse aux stress environnementaux, ce qui peut être imité dans les modèles de culture de tissus. Cette vidéo montre des techniques pour examiner la formation des parois du kyste en activant la moelle osseuse dérivées des macrophages ou des changements de pH moyen de croissance des cellules de fibroblastes.

Abstract

Toxoplasma gondii est un parasite intracellulaire obligatoire qui peut envahir toute cellule nucléée des animaux à sang chaud. Lors de l'infection, T. gondii diffuse comme une forme rapide répliquant appelé tachyzoïtes. Tachyzoïtes convertir en une forme à croissance lente enkystées appelé bradyzoite par un processus de signalisation qui ne sont pas bien caractérisés. Dans les animaux, les kystes bradyzoite sont trouvés dans le système nerveux central et les tissus musculaires et représentent la phase chronique de l'infection. Conversion à bradyzoïtes peut être simulé en culture de tissus par le CO ₂ la famine, l'aide moyenne avec un pH élevé, ou l'ajout d'interféron gamma (IFN). Bradyzoïtes sont caractérisées par la présence d'un kyste, à laquelle la lectine de Dolichos biflorus agglutinine (DBA) lie. DBA marqué par fluorescence est utilisée pour visualiser la paroi du kyste chez des parasites cultivés dans des fibroblastes de prépuce humain (HFFS) qui ont été exposés à faibles émissions de CO ₂ et moyennes pH élevé. De même, les parasites qui résident dans les os murins dérivés de la moelle macrophages (BMMs) affichent une paroi du kyste détectable par DBA après la BMMs sont activés avec IFN et de lipopolysaccharides (LPS). Ce protocole va montrer comment induire une conversion de T. gondii à l'aide d'un support bradyzoïtes pH élevé de croissance avec _le CO ₂ à faible et l'activation de BMMs. Les cellules hôtes seront cultivés sur des lamelles, infectés par tachyzoïtes et soit activé avec plus d'IFNy et LPS (BMMs) ou exposé à un milieu de croissance à pH élevé (HFFS) pendant trois jours. À la fin des infections, des cellules hôtes seront fixées, perméabilisées, et bloqués. Parois des kystes seront visualisés en utilisant la rhodamine DBA avec la microscopie à fluorescence.

Protocol

1. Préparation de fibroblastes de prépuce humain (HFF) enduit de lamelles

1. Placer une lamelle de verre stérile ronde sur le fond des puits d'une plaque de 24 puits de culture de tissu.
2. Pour récolter HFFS d'une confluence 150cm ² flacon, rincer le ballon deux fois avec du PBS 1X et ajouter 2,5 ml de 0,025% de trypsine-EDTA. Incuber flacon à 37 ° C pendant 5-10 minutes.
3. Exploiter le côté du ballon de contre la paume de votre main peut aider à détacher les cellules de la fiole. Une fois que les cellules ont libéré de la fiole, ajouter 150 ml de HFF moyennes (Dulbecco Modified Eagle Medium [DMEM] avec 10% de FBS, 2 mM de L-glutami....

Discussion

Bien que le mécanisme de développement bradyzoite n'est pas entièrement comprise, des analyses génétiques moléculaires de T. conversion de l'étape gondii dans la culture de tissus a conduit à la découverte des gènes qui sont impliqués dans la formation de kystes bradyzoite ^2,3,4. Les analyses ont également conduit à l'observation que certains marqueurs bradyzoite sont exprimés dans d'autres conditions de stress prolongé, y compris la croissance dans les macrophages activés

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Albumine sérique bovine	Sigma-Aldrich	A7906
Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)	GIBCO, par Life Technologies	11960-051
Sérum de veau fœtal (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150
Rhodamine inactivée par la chaleur Dolichos biflorus agglutinine	Vector Laboratories	RL-1032
Formaldéhyde (16 %)	Polysciences, Inc.	18814
Glycine	Fisher Scientific	BP381-5
HEPES	Fisher Scientific	BP310-1
IFNγ ;	PeproTech Inc	315-05	Stocker dans des aliquotes à usage unique
L-glutamine (200mM)	GIBCO, par Life Technologies	25030
Lipopolysaccharide (LPS)	Sigma-Aldrich	L4391-1MG	Stocker dans des aliquotes à usage unique
Couvercle de microscope Verre	Fisher Scientific	12-545-80 12CIR-1
Pénicilline-Streptomycine	GIBCO, par Life Technologies	15140
RPMI medium 1640 poudre (avec L-glutamine, sans bicarbonate)	GIBCO, par Life Technologies	31800-022
Triton-X-100	Fisher Scientific	BP151-500
Trypsine-EDTA (0,25 %)	GIBCO, par Life Technologies	25200
Supports de montage VectaShield avec DAPI	Vector Laboratories	H-1200